1、ICS 65.020.01 B 16 DB32 江 苏 省 地 方 标 准 DB32/T 3681 2019 小麦产毒镰刀菌种群分子分型技术 规范 Technical specification for molecular typing of toxin-producing fusarium species in wheat 2019 - 12 - 04 发布 2019 - 12 - 25 实施 江苏省市场监督管理局 发布 DB32/T 36812019 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.12009给出的规则起草。 本标准由江苏省农业科学院 提出并归口。 本标准起草单位:江苏省农业科学院。
2、 本标准主要起草人: 邢宇俊、仇剑波、董飞、徐剑宏、史建荣、吴季荣、陆丹丹。 DB32/T 36812019 1 小麦产毒镰刀菌种群分子 分型技术规范 1 范围 本标准规定了小麦产毒镰刀菌种群以及产毒素化学型区分中镰刀菌 DNA的提取、 PCR扩增、电泳 检测及结果判定方法和操作规范。 本标准适用于产毒镰刀菌种群及产毒化学类型的定性 PCR检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB 4789.15 食品安全国家标准 食品微生物检验 霉菌和酵母计数
3、 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 原理 产毒镰刀菌经过提取 DNA 后,利用特异性区分引物,通过普通 PCR 判断该样品是否为禾谷镰刀 菌或亚洲镰刀菌。根据关键特异基因 Tri11 来区分该样品是否产生 3ADON、 15ADON 或者雪腐镰刀烯 醇 NIV 化学型。 4 试剂和材料 4.1 水:应符合 GB/T 6682 中一级水的规格。 4.2 PDA 培养基:按 GB4789.15 规定。 4.3 CTAB 缓冲液 :55 mmol/L CTAB、 1400 mmol/L 氯化钠( NaCl)、 20 mmol/LEDTA、 100 mmol/L Tris-HCl(
4、 pH 8.0), 121 高压灭菌 20 min,储存于 2 8 。 4.4 TE 缓冲液。 4.5 RNA 酶溶液( 5g/L) 。 4.6 蛋白酶 K( 20mg/mL)。 4.7 Tri 饱和酚。 4.8 酚:三氯甲烷:异丙醇( 25: 24: 1);三氯甲烷:异戊醇( 24: 1)。 4.9 异丙醇 。 4.10 区分禾谷镰刀菌和亚洲镰刀菌引物 Fg16F: 5-CTCCGGATATGTTGCGTCAA-3 Fg16R: 5-GGTAGGTATCCGACATGGCAA-3 预期亚洲镰刀菌扩增片段大小为 497 bp; 预期禾谷镰刀菌扩增片段大小为 410 bp。 4.11 区分 3A
5、-DON、 5A-DON 和 NIV 化学型引物 DB32/T 36812019 2 Tri11-CON: 5-GACTGCTCATGGAGACGCTG-3 Tri11-3ADON: 5-TCCTCATGCTCG GTGGACTCG-3 Tri11-15ADON: 5-TGGTCCAGT TGTCCGTATT-3 Tri11-NIV: 5-GTAGGTTCCATTGC TTGTTC-3 预期产 3ADON 毒素类型扩增片段大小为 334 bp; 产 15ADON 毒素类型 扩增片段大小为 279bp ; 产 NIV 毒素类型扩增片段大小为 497 bp。 4.12 无水乙醇 。 4.13 DN
6、A Ladder: 可以清楚区分 100 bp 1000 bp 的 DNA 片段。 4.14 dNTPs 混合溶液 : 将浓度为 10 mmol/L 的 dATP、 dTTP、 dGTP、 dCTP 四种脱氧核糖核苷酸溶液 等体积混合。 4.15 Taq DNA 聚合酶、 PCR 扩增缓冲液及 25 mmol/L 氯化镁溶液。 4.16 50TAE 缓冲液:称取 484g Tris,量取 114 mL 冰乙酸, 200mL 0.5 mol/L EDTA,溶于水中,定 容至 2 L。分装后高压灭菌备用。使用时用水稀释成 1TAE 电泳缓冲液(工作液)。 4.17 加样缓冲液 。 4.18 琼脂糖
7、 。 4.19 溴化乙锭 。 5 主要仪器和设备 5.1 天平: 感量 0.1 g 和 0.1 mg。 5.2 PCR 扩增仪:升降温速度 1.5 /s,孔间温度差异 1.0 。 5.2 电泳槽、电泳仪等电泳装置。 5.3 紫外透射仪。 5.4 凝胶成像系统或照相系统。 5.5 高速冷冻离心机:转速不低于 12000 r/min。 5.6 培养箱 。 6 检测 6.1 样品制备与培养 参照 GB 4789.15 对样品进行稀释与培养。 6.2 DNA 提取 从培养平皿上刮取菌丝 0.2 g0.5 g 于 1.5 mL 灭菌离心管中,加入少许石英砂用细玻璃棒充分碾碎 菌丝,加入 500 L CT
8、AB、 40 L 蛋白酶 K,震荡均匀, 65C 水浴 30min;加入 500 L 酚:三氯甲烷: 异戊醇( 25: 24: 1),强烈震荡, 12000r/min 离心 15 min;吸取上层水相至 1.5 mL 离心管中,加入等 体积的异丙醇,震荡混匀, 12000r/min 离心 15 min;弃上清液 ,用预热至 65C TE 缓冲液溶解 DNA( TE 量视 DNA 沉淀的多少而定);加入 5 L RNA 酶溶液, 37C 水浴 30 min;加入 200 L 三氯甲烷:异 戊醇( 24: 1),强烈震荡, 12000r/min 离心 15 min;吸取上层水相至新的 1.5 mL
9、 离心管中,加入等体 积的异丙醇,震荡均匀, 12000r/min 离心 10 min;弃上清液,加入 1 mL70%冰 乙醇洗涤沉淀 DNA, 12000r/min 离心 10 min;弃上清液,无菌条件下自然干燥,加预热至 65C TE 缓冲液溶解 DNA(如不 能及时检验,可将提取液于 -20C 保存) DB32/T 36812019 3 也可使用等效的真菌基因组 DNA 提取试剂盒。 6.3 PCR 检测 6.3.1 区分禾谷镰刀菌和亚洲镰刀菌检测 6.3.1.1 PCR 反应体系 在 PCR 管中按表 1 依次加入反应试剂,混匀。也可采用经验证的、等效的定性 PCR 试剂盒配制反 应
10、体系。 表 1 PCR 检测反应体系 试剂 终浓度 体积 水 10PCR 缓冲液 1 2.5 L 25 mmol/L 氯化镁溶液 1.5 mmol/L 1.5 L dNTPs 混合溶液(各 2.5 mmol/L) 各 0.2 mmol/L 2.0 L 10 mol/L Fg16F 0.3 mol/L 0.75 L 10 mol/L Fg16R 0.3 mol/L 0.75 L Taq DNA 聚合酶 0.025 U/L 25 mg/L DNA 模板 2 mg/L 2.0 L 总体积 25.0 L “”表示体积不确定,如果 PCR 缓冲液中含有氯化镁,则不加氯化镁 溶液,根据 Taq DNA 聚
11、合酶的浓度确定其 体积,并相应调整水的体积,使反应体系总体积达到 25.0 L。 6.3.1.2 PCR 反应程序 反应程序为: 94 变性 5 min; 94 变性 30 s, 58 退火 30 s, 72 延伸 30 s,共进行 35 次循 环; 72 延伸 10 min。 不同仪器、不同 Taq DNA 聚合酶可根据要求将反应条件做适当调整。 6.3.1.3 PCR 结果检测 用电泳缓冲液( 1TAE)制备 2%琼脂糖凝胶( 55 60 时加入溴化乙锭至终浓度为 0.5 g/ml, 也可在电泳后进行染色)。取 8 L15 L PCR 扩增产物,加入 2 L 上样缓冲液混合,进行点样,用
12、DNA Ladder 作参照, 9 v/cm 恒压电泳,电泳 40 min60 min,电泳结束后,置于凝胶成像仪上或紫外透射仪 上成像。根据 DNA 分子量标准估计扩增条带的大小,将电泳结果形成电子文件存档或用照相系统拍照。 在样品 PCR 扩增 的同时,应设置 PCR 阴性对照、 PCR 阳性对照和 PCR 空白对照,实验重复三次。 6.3.2 3ADON、 15ADON 和 NIV 化学 型检测 6.3.2.1 PCR 反应体系 在 PCR 管中按表 2 依次加入反应试剂,混匀。也可采用经验证的、等效的定性 PCR 试剂盒配制反应体 系。 DB32/T 36812019 4 表 2 PC
13、R 检测反应体系 试剂 终浓度 体积 水 10PCR 缓冲液 1 2.5 L 25 mmol/L 氯化镁溶液 1.5 mmol/L 1.5 L dNTPs 混合溶液(各 2.5 mmol/L) 各 0.2 mmol/L 2.0 L 10 mol/L Tri11-CON 0.3 mol/L 0.75 L 10 mol/L Tri11-3ADON 0.3 mol/L 0.75 L 10 mol/L Tri11-15ADON 0.3 mol/L 0.75 L 10 mol/L Tri11-NIV 0.3 mol/L 0.75 L Taq DNA 聚合酶 0.025 U/L 25 mg/L DNA 模
14、板 2 mg/L 2.0 L 总体积 10 mol/L 25.0 L “”表示体积不确定,如果 PCR 缓冲液中含有氯化镁,则不加氯化镁溶液,根据 Taq DNA 聚合酶的浓度 确定其体积,并相应调整水的体积,使反应体系总体积达到 25.0 L。 6.3.2.2 PCR 反应程序 反应程序为: 94 变性 5 min; 94 变性 30 s, 58 退火 30 s, 72 延伸 30 s,共进行 35 次循 环; 72 延伸 10 min。 不同仪器、不同 Taq DNA 聚合酶可根据要求将反应条件做适当调整。 6.3.2.3 PCR 结果检测 用电泳缓冲液( 1TAE)制备 2%琼脂糖凝胶(
15、 55 60 时加入溴化乙锭至终浓度为 0.5 g/mL, 也可在电泳后进行染色)。取 8 L15 L PCR 扩增产物,加入 2L 上样缓冲 液混合,进行点样,用 DNA Ladder 作参照, 9 v/cm 恒压电泳,电泳 40 min60 min,电泳结束后,置于凝胶成像仪上或紫外透射仪 上成像。根据 DNA 分子量标准估计扩增条带的大小,将电泳结果形成电子文件存档或用照相系统拍照。 在样品 PCR 扩增 的同时,应设置 PCR 阴性对照、 PCR 阳性对照和 PCR 空白对照,实验重复三次。 7 判定 7.1 区分禾谷镰刀菌和亚洲镰刀菌判定 7.1.1 样品中扩增出预期 497 bp
16、条带,则表示样品是 亚洲镰刀菌 ;样品未扩增出预期 497 bp 条带,则表 示样品不是 亚洲 镰刀菌 ; 7.1.2 样品中扩增出预期 410 bp 条带,则表示样品是 禾谷镰刀菌 ;样品未扩增出预期 410 bp 条带,则表 示样品不是 禾谷镰刀菌 。 7.2 3ADON、 5ADON 和 NIV 化学型判定 7.2.1 样品中扩增出预期 334 bp 条带,表示样品产 3ADON;样品未扩增出预期 334 bp 的条带,则表示 样品不产 3ADON; 7.2.2 样品中扩增出预期 279 bp 条带,表示样品产 15ADON;样品未扩增出预期 279 bp 的条带,则表 示样品不产 15ADON; 7.2.3 样品中扩增出预期 497 bp 条带,表示 样品产 NIV;样品未扩增出预期 497 bp 的条带,则表示样品 不产 NIV。 DB32/T 36812019 5 8 质量控制 阳性对照 PCR 中扩增片段大小与预期片段大小一致, 而阴性对照、 空白对照 PCR 中没有预期扩增 片段,表明 PCR 检测反应体系正常工作。否则,重新检测。 _