1、 ICS 11.220 B 41 江 苏 省 地 方 标 准 DB32 DB32/T 36832019 猪链球菌 9 型 PCR 检测技术规程 Technical regulation for PCR detecting Streptococcus suis Serotype 9 2019-12-04 发布 2019-12-25 实施 江苏省市场监督管理局 发布 DB32/T 36832019 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.12009给出的规则起草。 本标准由江苏省农业科学院提出并归口。 本标准起草单位：江苏省农业科学院。 本标准主要起草人：倪艳秀、何孔旺、周俊明、祝昊丹、吕立新、俞正
2、玉、王丹丹、张雪寒、温立 斌、李彬。 DB32/T 36832019 1 猪链球菌 9 型 PCR 检测技术规程 1 范围 本标准规定了猪链球菌 9型 PCR检测技术所用的仪器设备和主要试剂、引物、方法步骤、结果判定、 废弃物处理和防止污染的措施 等 要求 。 本标准适用于猪链球菌 9 型的 PCR 检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件 的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 病
3、死及病害动物无害化处理技术规范（农医发 2017 25号） 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 猪链球菌 9型 Streptococcus suis serotype 9 属于链球菌属的一种细菌，根据其荚膜多糖抗原的差异，可分 为 1-31、 33及 1/2共 33个血清型。猪 链球菌 9型是猪链球菌的一个血清型，不仅对猪致病性很强，而且可以感染特定的人群，是一种人兽共 患病病原菌。 4 仪器设备和主要试剂 4.1 仪器设备 高速离心机、水浴锅、 PCR仪、 核酸电泳仪、凝胶成像系统。 4.2 主要试剂 生理盐水 、 超纯水 、 蛋白酶 K、 2PCR Mix、琼脂糖（电泳级
4、）、 DNA分子量标准（ DL 2000 Marker） 。 5 引物 5.1 上游引物： 5- GGCTACATATAATGGAAGCCC- 3。 5.2 下游引物： 5- CCGAAGTATCTGGGCTACTG- 3。 6 方法步骤 6.1 样品处理 6.1.1 病料样品处理 DB32/T 36832019 2 采用差速离心法，取约 5 g 病料（肝或肺或脑组织），剪碎研磨，用 5 mL 生理盐水混悬，先 2 000 r/min 离心 2 min，去除大组织块，取上清液，后 10 000 r/min 离心 5 min，弃上清液，沉淀以 200 L 超 纯水重悬，备用。 6.1.2 待检培
5、养物样品处理 取待检液体培养物（纯培养物或混合培养物） 1 mL 10 000 r/min 离心 5 min，弃上清，沉淀以 200 L 超纯水重悬，备用。 阴性对照： THB 培养基。阳性对照：猪链球菌 9 型标准菌株（ 22083）的 THB 培 养物。阴性、阳性对照也同样处理，对每个样品进行编号标记。 6.2 DNA提取 取 6.1 获得的样品及对照，每 200 L 加入 3 L 蛋白酶 K（ 20 mg/mL）， 42 作用 1 h，煮沸 5 min， 10 000 r min 离心 5 min，上清作为模板 DNA。 6.3 PCR扩增 6.3.1 反应条件 按 25 L 体系进行，
6、 2 PCR Mix 12.5 L，上游引物（ 10 pmol/L） 1.0 L，下游引物（ 10 pmol/L） 1.0 L，模板 DNA 2.0 L，超纯水 8.5 L。按如下条件进行 PCR 反应。 95 5 min，然后进入循环 94 30 sec， 55 30 sec， 72 30 sec， 35 个循环，于 72 延伸 10 min， 4 保存。 6.3.2 电泳 将 PCR 反应产物于 1.2 %琼脂糖凝胶进行电泳，电压为 120 V，时间 30 min。 6.3.3 结果观察 用凝胶成像系统观察结果，并进行拍照。 7 结果判定 7.1 检测结果成立条件 阳性对照的 PCR产物电
7、泳后在 389 bp的位置上出现一条特异性条带，阴性对照 PCR产物电泳后没有 条带（见附录 A），检测结果成立；否则，结果不成立。 7.2 结果判定 7.2.1 在检测结果成立的前提下，如果检测样品中 PCR产物电泳后在 389 bp的位置上出现一条特异性条 带， 判为阳性，即该样品为猪链球菌 9型核酸阳性 。 7.2.2 在检测结果成立的前提下，如果检测样品中 PCR产物电泳后在 389 bp的位置上未出现一条特异性 条带， 判为阴性，即该样品为猪链球菌 9型核酸阴性。 7.2.3 如果阳性对照无相应的目的条带， 可能是存在操作失误，该检测需要重复进行；如果阴性对照有 相应的目的条带，可能
8、是阴性对照存在污染或是操作失误，该检测需要重复进行。 8 废弃物处理和防止污染的措施 检测过程中的废弃物，应做好无害化处理。检测过程中防止交叉污染的措施见附录 B。 DB32/T 36832019 3 附 录 A (资料性附录 ) 猪链球菌 9型 PCR产物电泳图 MDNA分子量标准（ DL 2000 Marker）； 1阳性对照； 2阴性对照。 图 A.1 猪链球菌 9型 PCR产物电泳图 389bp 2000bp 1000bp 750bp 500bp 250bp 100bp M 1 2 DB32/T 36832019 4 附 录 B (规范性附录 ) 检测过程中防 止交叉污染的措施 B.1
9、 抽样和制样过程 抽样和制样工具，应清洗干净， 121 ， 15 min 20 min灭菌，一套清洁工具限于一个样品使用。 存放样品的容器应该经过清洗、灭菌，或为一次性灭菌容器。 B.2 检测过程 B.2.1 PCR实验室应分为样品制备区、前 PCR区、 PCR区、后 PCR区。将模板提取、 PCR反应液配制、 PCR循环扩增及 PCR产物的鉴定等步骤分区或分室进行。实验室的运作应从 “净区 ”到 “脏区 ”单方向进 行。 B.2.2 实验过程中，应穿实验服和戴手套，手套要经常更换。各区要有专用实验 服，经常清洗。 B.2.3 各区所有的试剂、器材 (尤其是移液器 )、仪器都应专用，不得带出该区。 B.2.4 所有溶液、水、耗材和器具要 121 ， 15 min 20 min灭菌，避免核酸和 (或 )核酸酶污染。每种 溶液应使用高质量的成分和超纯水。所有试剂应该以大体积配制，然后分装成仅够一次使用的量进行贮 存。 B.2.5 装有 DNA模板或引物的离心管打开之前，要简短离心，离心管不能用力崩开，以免产生气溶胶。 B.2.6 前 PCR区中，在 PCR操作箱中加人 PCR反应各组分。 B.2.7 实验前后，实验室用 紫外线消毒以破坏残留的 DNA。 _
