DB23 T 2525—2019 主要肥效微生物筛选技术规程.pdf

1、ICS 65.020.20B05 DB23黑 龙 江 省 地 方 标 准DB23/T 2525 2019主 要 肥 效 微 生 物 筛 选 技 术 规 程 2019-12-13发 布 2020-01-12实 施黑 龙 江 省 市 场 监 督 管 理 局 发 布 DB23/T 25252019 I 前 言本 标 准 依 据 GB/T 1.1的 编 写 规 则 起 草 。本 标 准 由 黑 龙 江 省 农 业 农 村 厅 提 出 。本 标 准 由 黑 龙 江 省 农 业 标 准 化 技 术 委 员 会 归 口 。本 标 准 由 黑 龙 江 省 农 业 科 学 院 土 壤 肥 料 与 环 境 资 源

2、 研 究 所 和 哈 尔 滨 市 芮 煊 科 技 有 限 公 司 起 草 。本 标 准 主 要 起 草 人 ： 王 爽 、 赵 晓 宇 、 李 伟 群 、 陈 雪 丽 、 万 书 明 、 孙 磊 、 姜 辉 、 王 晓 军 、 张 磊 、 常 本超 。 DB23/T 25252019 1 主 要 肥 效 微 生 物 筛 选 技 术 规 程1 范 围本 标 准 规 定 了 主 要 肥 效 微 生 物 筛 选 技 术 的 术 语 和 定 义 ， 样 品 采 集 ， 肥 效 微 生 物 的 筛 选 及 保 藏 。本 标 准 适 用 于 根 瘤 菌 、 溶 磷 菌 和 解 钾 菌 三 种 肥 效 微

3、生 物 的 筛 选 。2 规 范 性 引 用 文 件下 列 文 件 对 于 本 文 件 的 应 用 是 必 不 可 少 的 。 凡 是 注 日 期 的 引 用 文 件 ， 仅 注 日 期 的 版 本 适 用 于 本 文 件 。凡 是 不 注 日 期 的 引 用 文 件 ， 其 最 新 版 本 （ 包 括 所 有 的 修 改 单 ） 适 用 于 本 文 件 。NY/T 889-2004 土 壤 速 效 钾 和 缓 效 钾 含 量 的 测 定 LY/T 1232-2015 森 林 土 壤 全 磷 的 测 定SN/T 2632 微 生 物 菌 种 常 规 保 藏 技 术 规 程3 术 语 和 定 义

4、下 列 术 语 和 定 义 适 用 于 本 文 件 。3.1 肥 效 微 生 物从 自 然 界 分 离 筛 选 ， 通 过 自 身 代 谢 活 动 产 生 固 氮 、 溶 磷 、 解 钾 等 功 能 ， 使 植 物 获 得 特 定 肥 料 效 应 ，并 可 用 于 微 生 物 肥 料 生 产 的 微 生 物 。 本 标 准 中 的 肥 料 微 生 物 主 要 指 根 瘤 菌 、 溶 磷 菌 和 解 钾 菌 。3.2 透 明 圈在 琼 脂 平 板 上 ， 溶 磷 菌 在 培 养 过 程 中 分 泌 有 机 酸 ， 将 培 养 基 中 不 透 明 的 难 溶 磷 酸 钙 溶 解 后 形 成 的 透

5、 明 区 。4 样 品 采 集4.1 主 要 用 具铁 锹 、 小 铲 、 镊 子 、 GPS 定 位 仪 、 记 号 笔 、 装 土 袋 子 （ 布 袋 ） 、 塑 料 袋 、 剪 子 、 标 签 纸 、 冰 盒 、 75%酒 精 、 吸 水 纸 、 变 色 硅 胶 离 心 管 。4.2 根 瘤 样 品 采 集4.2.1 采 样 时 间选 择 豆 科 作 物 盛 花 期 采 集 根 瘤 。 4.2.2 采 样 方 法 DB23/T 25252019 2 视 土 壤 水 分 、 通 气 状 况 和 植 株 大 小 决 定 植 物 根 系 的 挖 掘 深 度 ， 将 整 株 植 物 的 根 系

6、挖 出 ， 轻 轻 敲 掉 根系 周 围 大 的 土 块 ， 然 后 将 根 放 入 塑 料 袋 中 ， 贴 好 标 签 带 回 实 验 室 。4.2.3 根 瘤 样 品 的 保 存轻 轻 抖 去 根 系 上 的 土 壤 ， 将 根 在 水 中 浸 泡 、 洗 净 、 晾 干 或 用 吸 水 纸 吸 干 。 用 剪 刀 将 主 根 上 个 大 、 粉红 色 的 瘤 子 （ 带 点 根 ） 小 心 剪 下 ， 保 存 于 盛 有 干 燥 剂 （ 采 用 变 色 硅 胶 ） 的 5mL的 离 心 管 中 ， 置 于 4 条件 下 冷 藏 存 放 ， 每 天 对 保 存 物 进 行 检 查 ， 发

7、现 硅 胶 由 蓝 色 完 全 变 为 红 色 时 ， 应 及 时 转 移 到 新 管 子 中 。 在15d内 完 成 根 瘤 菌 的 分 离 工 作 。4.3 土 壤 样 品 采 集4.3.1 采 样 时 间溶 磷 、 解 钾 微 生 物 来 源 的 土 壤 样 品 采 集 可 在 植 物 生 长 的 整 个 过 程 中 进 行 。 4.3.2 采 样 方 法去 掉 地 表 大 块 沙 石 和 其 他 杂 物 。 根 际 土 壤 ， 用 干 净 铁 锹 或 小 铲 沿 植 物 周 围 往 下 挖 ， 尽 量 将 整 株 植 物的 根 系 挖 出 ， 轻 轻 敲 掉 根 系 周 围 大 的 土

8、 块 ， 然 后 将 根 放 入 塑 料 袋 中 ， 将 根 上 土 抖 下 或 用 手 从 塑 料 袋 外 从根 上 撵 下 ， 贴 上 标 签 ， 封 口 ， 同 时 在 塑 料 封 口 袋 上 写 清 采 样 编 号 ， 放 入 冰 盒 带 回 实 验 室 处 理 。 根 围 土 壤 ，采 样 深 度 一 般 是 0cm 30cm 土 层 ， 需 记 录 采 取 土 样 的 深 度 （ cm） 和 距 离 植 株 根 系 的 距 离 （ cm） ， 沿 植 物外 10cm周 围 往 下 挖 5cm 20cm的 土 壤 ， 在 植 物 周 围 对 称 采 集 5 个 点 的 土 壤 样 本

9、 。 然 后 放 入 塑 料 袋 中 ，贴 上 标 签 ， 封 口 ， 同 时 在 塑 料 封 口 袋 上 写 清 采 样 编 号 ， 放 入 冰 盒 带 回 实 验 室 处 理 。 采 集 不 同 采 样 点 前 需将 工 具 上 的 残 土 清 理 干 净 。5 肥 效 微 生 物 的 筛 选5.1 根 瘤 菌 的 筛 选 5.1.1 根 瘤 菌 的 分 离4.2.3中 的 保 存 的 根 瘤 样 品 用 95%乙 醇 浸 泡 根 瘤 30s， 无 菌 水 清 洗 3次 4次 ， 再 用 0.1%升 汞 （ 氯 化 汞 ）浸 泡 根 瘤 5min， 再 用 无 菌 水 冲 洗 根 瘤 4次

10、 5次 。 在 无 菌 环 境 下 用 无 菌 刀 片 切 开 根 瘤 ， 用 无 菌 镊 子 夹 取 根瘤 ， 使 横 断 面 接 触 配 置 好 的 YMA培 养 基 （ 配 置 方 法 见 附 录 A1） 斜 面 或 平 板 表 面 ， 并 将 根 瘤 内 汁 液 涂 布 于培 养 基 表 面 ， 在 试 管 或 培 养 皿 表 面 写 好 编 号 ， 放 在 25 28 恒 温 培 养 箱 中 倒 置 培 养 ， 在 20d内 每 天 观察 ， 视 菌 落 生 长 情 况 决 定 培 养 时 间 。5.1.2 根 瘤 菌 的 纯 化事 先 准 备 好 无 菌 的 带 玻 璃 珠 加 水

11、 的 试 管 或 离 心 管 一 支 ， 在 无 菌 环 境 下 从 试 管 或 平 板 上 长 出 的 乳 白色 、 凸 起 菌 落 挑 出 一 接 种 环 入 管 内 水 中 ， 在 振 荡 器 上 振 荡 1min， 使 菌 苔 充 分 分 散 成 菌 悬 液 ， 取 一 环 菌 液在 YMA固 体 培 养 基 上 划 线 接 种 ， 平 板 放 在 25 28 恒 温 培 养 箱 中 倒 置 培 养 。 待 菌 落 长 出 后 ， 挑 取 乳 白色 、 凸 起 的 菌 落 反 复 划 线 3次 以 上 获 得 纯 菌 落 。 5.1.3 根 瘤 菌 结 瘤 能 力 的 验 证可 选 用

12、 如 下 三 种 方 法 之 一 进 行 根 瘤 菌 的 回 接 结 瘤 实 验 ： DB23/T 25252019 3 a） 水 培 法 ： 培 养 基 质 为 微 氮 培 养 液 ， 其 配 方 见 附 录 A6和 A7， 按 照 附 录 B1的 步 骤 完 成 根 瘤 菌 结 瘤 能力 的 验 证 。b） 砂 培 法 ： 培 养 基 质 为 加 入 微 氮 培 养 液 的 石 英 砂 ， 按 照 附 录 B2的 步 骤 完 成 根 瘤 菌 结 瘤 能 力 的 验 证 。c） 土 培 法 ： 培 养 基 质 为 灭 菌 土 壤 ， 按 照 附 录 B3的 步 骤 完 成 根 瘤 菌 结 瘤

13、 能 力 的 验 证 。观 察 各 植 株 根 部 结 瘤 情 况 ， 记 录 植 株 株 高 （ cm） 、 主 根 和 侧 根 的 瘤 数 （ 个 /株 ） 、 主 根 和 侧 根 瘤 重（ g/株 ） 、 地 上 部 鲜 重 （ g/株 ） 。5.2 溶 磷 、 解 钾 菌 的 筛 选5.2.1 溶 磷 、 解 钾 菌 的 分 离称 取 土 样 10g， 置 于 装 有 无 菌 玻 璃 珠 的 三 角 瓶 中 ， 分 离 溶 磷 菌 应 加 入 90mL无 菌 水 ， 分 离 解 钾 菌 应 加入 0.85%NaCl溶 液 。 常 温 下 以 160rpm/min的 转 速 振 荡 20

14、min， 制 成 均 匀 的 土 壤 悬 液 。 采 用 10倍 稀 释 法 依 次配 制 10 -1 10-6的 浓 度 梯 度 样 液 ， 选 取 10-4、 10-5、 10-6 3个 浓 度 梯 度 的 样 液 。 分 离 解 磷 菌 时 ， 每 次 每 个 浓度 样 液 吸 取 0.1mL， 涂 布 于 PKO无 机 磷 （ 附 录 A2） 和 蒙 金 娜 有 机 磷 （ 附 录 A3） 固 体 培 养 基 平 板 上 ， 每 个 稀释 度 设 3个 重 复 ， 30 培 养 箱 中 倒 置 培 养 7d； 分 离 解 钾 菌 时 ， 每 次 每 个 浓 度 样 液 吸 取 0.1m

15、L， 涂 布 于 解 钾菌 筛 选 培 养 基 （ 附 录 A4） 平 板 上 ， 每 个 稀 释 度 设 3个 重 复 ， 28 培 养 箱 中 倒 置 培 养 3d 4d。5.2.2 溶 磷 、 解 钾 菌 的 纯 化挑 取 每 个 梯 度 的 平 板 上 有 透 明 圈 的 菌 落 ， 并 用 1， 2， 3， 4.来 标 注 ， 测 量 透 明 圈 直 径 （ D） 、 菌 落直 径 （ d） ， 根 据 是 否 产 生 透 明 圈 以 及 D/d值 大 小 来 初 步 确 定 菌 株 的 溶 磷 解 钾 能 力 的 强 弱 。 判 定 标 准 如 下 ：解 磷 （ 钾 ） 效 果 弱

16、 ： 0 D/d 1.0解 磷 （ 钾 ） 效 果 中 等 ： 1.0 D/d 1.5解 磷 （ 钾 ） 效 果 较 强 ： 1.5 D/d 3.0解 磷 （ 钾 ） 效 果 强 ： D/d 3.0 将 D/d 1.5的 菌 落 利 用 平 板 划 线 法 分 离 纯 化 后 ， 再 用 接 种 针 挑 取 有 明 显 透 明 圈 的 菌 落 ， 进 一 步 通 过平 板 划 线 法 纯 化 ， 直 至 得 到 纯 菌 株 后 ， 转 到 牛 肉 膏 蛋 白 胨 斜 面 培 养 基 （ 附 录 A5） 上 ， 保 存 于 4 冰 箱 中 。5.2.3 溶 磷 能 力 的 测 定在 500mL三

17、 角 瓶 中 分 别 装 入 100mL的 PKO无 机 磷 液 体 培 养 基 （ 附 录 A2无 琼 脂 ） 和 100mL蒙 金 娜 有 机 磷 液体 培 养 基 （ 附 录 A3无 琼 脂 ） ， 121 高 压 灭 菌 30min后 备 用 。 然 后 将 溶 磷 圈 法 初 筛 得 到 的 菌 株 接 种 到 牛 肉膏 蛋 白 胨 斜 面 培 养 基 上 ， 于 28 培 养 24h， 挑 取 细 菌 接 入 到 无 菌 水 中 ， 制 成 含 菌 量 107个 /mL的 菌 悬 液 ，取 1mL菌 悬 液 ， 分 别 对 应 接 种 至 PKO无 机 磷 液 体 培 养 基 和

18、100mL蒙 金 娜 有 机 磷 液 体 培 养 基 ， 以 培 养 基 中 加入 1mL无 菌 水 作 为 对 照 ， 每 个 处 理 3次 重 复 ， 振 荡 培 养 （ 28 ， 150rpm/min） 5d。 然 后 在 4 条 件 下 对 培养 液 进 行 离 心 （ 4000rpm/min） 15min， 吸 取 上 清 液 ， 按 照 LY/T 1232-2015中 4有 效 磷 的 测 定 方 法 测 定 上清 液 可 溶 性 磷 含 量 。5.2.4 解 钾 能 力 的 测 定 将 在 三 角 瓶 中 培 养 好 的 解 钾 细 菌 发 酵 液 倒 出 ， 从 中 定 容 5

19、0mL， 将 发 酵 液 在 500rpm/min下 离 心 10min，除 去 发 酵 液 中 的 不 溶 性 物 质 ， 然 后 取 10mL菌 液 10000rpm/min离 心 10min， 上 清 液 中 的 钾 含 量 测 定 按 照 NY/T889-2004中 3.1的 规 定 测 定 速 效 钾 含 量 。 测 定 菌 体 钾 含 量 之 前 ， 先 将 菌 体 与 残 渣 经 碾 钵 充 分 撵 磨 ， 用 10mL去 离 子 水 浸 提 ， 再 用 移 液 管 吸 取 4mL上 清 液 与 4mL 6mmol/L的 LiCl充 分 混 匀 ， 按 照 NY/T 889-20

20、04中 3.1的 规 定 测 定 速 效 钾 含 量 。6 肥 效 微 生 物 的 保 藏 DB23/T 25252019 4 6.1 根 瘤 菌 的 保 藏挑 取 结 瘤 能 力 强 的 根 瘤 菌 进 行 保 藏 ， 按 照 SN/T 2632的 规 定 进 行 。6.2 溶 磷 、 解 钾 微 生 物 的 保 藏挑 选 生 长 旺 盛 、 具 有 较 大 溶 磷 、 解 钾 圈 的 菌 株 进 行 保 藏 ， 按 照 SN/T 2632的 规 定 进 行 。 DB23/T 25252019 5 附 录 A（ 规 范 性 附 录 ）培 养 基 配 方 及 缓 冲 液A1 YMA培 养 基甘

21、 露 醇 ， 10.0g； 酵 母 粉 ， 0.8g； K2HPO4， 0.25g； KH2PO4， 0.25g； MgSO47H2O， 0.2g； NaCl， 0.1g；0.25%溴 麝 香 草 酚 蓝 （ 仅 在 从 根 瘤 中 分 离 根 瘤 菌 时 选 择 性 的 加 入 ） ， 1ml； 琼 脂 ， 15g 18g； 蒸 馏 水 ， 1000ml；pH值 ， 6.8 7.0。A2 PKO无 机 磷 培 养 基葡 萄 糖 ， 10g； Ca 3(PO4)2， 5g； (NH4)SO4 0.5g； NaCl， 0.2g； KCl， 0.2g； MgSO47H2O， 0.3g； MnSO4

22、4H2O，0.03g； FeSO47H2O， 0.03g； 酵 母 膏 ， 0.5g； 琼 脂 ， 15g 20g； 蒸 馏 水 ， 1000mL； pH 值 ， 6.8 7.0。A3 蒙 金 娜 有 机 磷 培 养 基葡 萄 糖 ， 10g； (NH4)SO4， 0.5g； NaCl， 0.3g； KCl， 0.3g； FeSO47H2O， 0.03g； MnSO44H2O， 0.03g；卵 磷 脂 ， 0.2g； CaCO3， 5g； 酵 母 膏 ， 0.4g； 琼 脂 ， 15g 20g； 蒸 馏 水 ， 1000mL； pH 值 ， 7.0 7.2。A4 解 钾 菌 筛 选 培 养 基

23、蔗 糖 ， 5g； Na2HPO4， 2g； MgSO47H2O， 0.5g； FeCl3,0.005g； CaCO3， 0.1g； 钾 长 石 粉 ， 1g（ 过 100目 筛 后 无 菌 水 浸 泡 3d， 除 去 水 溶 性 钾 ） ， 琼 脂 ， 18g 20g； 蒸 馏 水 ， 1000mL； pH 值 ， 7.0 7.5。A5 牛 肉 膏 蛋 白 胨 培 养 基牛 肉 膏 ， 3g； 蛋 白 胨 ， 5g； 琼 脂 18g 20g； 蒸 馏 水 ， 1000mL； pH 值 ， 7.0 7.2。A6 液 体 微 氮 培 养 基Ca(NO 3)24H2O， 0.03g； CaSO4，

24、 0.46g； KCl， 0.075g； MgSO47H2O， 0.06g； K2HPO4， 0.136g； 柠 檬 酸铁 ， 0.075g； 微 量 元 素 ， 1mL； 蒸 馏 水 ， 1000mL。A7 微 量 元 素H3BO3， 2.86g； MnSO4， 1.81g； ZnSO4， 0.22g； CuSO45H2O,0.8g； H2MoO4， 0.02g； 蒸 馏 水 1000mL。附 录 B（ 规 范 性 附 录 ）试 验 方 法B1 水 培 法B1.1 微 氮 培 养 液 的 配 制按 附 录 A6和 A7将 各 种 成 分 称 好 后 ， 放 入 1000mL烧 杯 中 加 水

25、 使 之 溶 解 ， 即 为 培 养 液 （ 可 先 配 制 成 浓 缩液 ， 然 后 定 量 稀 释 装 瓶 ） 。 将 滤 纸 剪 成 合 适 大 小 ， 卷 成 筒 放 入 大 试 管 内 （ 5cm 20cm） ， 并 贴 于 试 管 内壁 上 ， 以 固 定 发 芽 的 种 子 ； 培 养 液 装 入 大 试 管 中 ， 用 透 气 滤 膜 和 牛 皮 纸 封 口 ， 121 灭 菌 30min后 冷 却 备用 。 B1.2 幼 苗 培 养挑 取 饱 满 、 新 鲜 、 无 破 损 的 豆 科 植 物 种 子 ， 放 入 灭 菌 容 器 （ 培 养 皿 或 烧 杯 ） 内 按 本 标

26、 准 5.1.1中 消毒 根 瘤 的 方 法 进 行 消 毒 后 ， 放 入 垫 有 滤 纸 的 加 无 菌 水 的 无 菌 培 养 皿 或 0.5%的 水 琼 脂 平 板 上 ， 放 于 20 25 培 养 箱 内 发 芽 。 待 种 子 幼 苗 根 系 长 至 1cm 2cm， 即 可 接 种 并 播 种 到 已 经 灭 菌 备 用 的 大 试 管 中 。B1.2 接 种 及 培 养根 据 植 物 种 子 萌 发 的 时 间 和 条 件 ， 预 先 将 回 接 的 菌 株 在 YEM斜 面 上 活 化 后 ， 于 YEM液 体 培 养 基 扩 大 培养 至 对 数 生 长 期 。 将 1m

27、L菌 悬 液 倒 入 无 菌 培 养 皿 中 ， 选 择 附 录 B1.2中 生 长 一 致 的 幼 苗 在 其 中 浸 泡 30min后 转 移 到 无 菌 试 管 中 ， 剩 余 的 菌 液 直 接 加 到 培 养 植 物 的 容 器 中 ， 液 体 内 菌 液 浓 度 以 10 3 106CFU/mL为 宜 。大 试 管 外 包 裹 一 层 锡 纸 或 牛 皮 纸 ， 以 避 光 模 拟 根 部 环 境 。 回 接 后 应 立 即 送 光 照 室 、 温 室 或 自 然 光 照 下 培养 ， 温 度 以 12 25 为 宜 ， 经 常 观 察 并 补 加 水 分 。B2 砂 培 法 DB23/T 25252019 6 将 灭 过 菌 的 石 英 砂 等 基 质 装 入 花 盆 中 ， 加 入 微 氮 培 养 液 ， 将 附 录 B1.2中 生 长 一 致 的 幼 苗 移 入 石 英 砂中 ， 培 养 同 附 录 B1.3。B3 土 培 法将 灭 过 菌 的 土 装 入 花 盆 中 ， 装 土 量 视 花 盆 大 小 而 定 。 将 附 录 B1.2中 生 长 一 致 的 幼 苗 移 入 花 盆 中 ， 培养 同 附 录 B1.3。