1、ICS 65.020.20B 16 DB23黑 龙 江 省 地 方 标 准DB23/T 24762019大 豆 孢 囊 线 虫 病 抗 性 室 内 鉴 定 方 法 2019-11-20 发 布 2019- 12-19实 施黑 龙 江 省 市 场 监 督 管 理 局 发 布 DB23/T 24762019 I 前 言本 标 准 依 据 GB/T 1.1 2009 的 编 写 规 则 起 草 。本 标 准 由 黑 龙 江 省 农 业 农 村 厅 提 出 。本 标 准 由 黑 龙 江 省 农 业 标 准 化 技 术 委 员 会 归 口 。本 标 准 起 草 单 位 ： 中 国 科 学 院 东 北 地
2、 理 与 农 业 生 态 研 究 所 农 业 技 术 中 心 、 哈 尔 滨 瑞 康 源 生 物 科 技 有限 公 司 、 黑 龙 江 省 绿 色 食 品 科 学 研 究 院 。本 标 准 主 要 起 草 人 ： 李 春 杰 、 王 从 丽 、 尤 佳 、 胡 岩 峰 、 王 英 男 、 潘 凤 娟 、 黄 铭 慧 、 姜 野 。 DB23/T 24762019 2 大 豆 孢 囊 线 虫 病 抗 性 室 内 鉴 定 方 法1 范 围本 标 准 规 定 了 大 豆 孢 囊 线 虫 病 抗 性 室 内 鉴 定 方 法 中 的 试 剂 、 材 料 和 仪 器 设 备 、 空 气 环 境 与 培 养
3、 条 件 、鉴 定 材 料 、 育 苗 与 移 苗 、 培 养 、 线 虫 接 种 液 制 备 、 接 种 、 调 查 、 抗 性 评 价 方 法 。本 标 准 适 用 于 对 大 豆 孢 囊 线 虫 不 同 生 理 小 种 的 抗 性 鉴 定 。2 规 范 性 引 用 文 件下 列 文 件 对 于 本 文 件 的 应 用 是 必 不 可 少 的 。 凡 是 注 日 期 的 引 用 文 件 ， 仅 注 日 期 的 版 本 适 用 于 本 文 件 。凡 是 不 注 日 期 的 引 用 文 件 ， 其 最 新 版 本 （ 包 括 所 有 的 修 改 单 ） 适 用 于 本 文 件 。 GB 309
4、5 环 境 空 气 质 量 标 准GB 4404.2 粮 食 作 物 种 子 第 2 部 分 ： 豆 类NY/T 3059 大 豆 抗 孢 囊 线 虫 鉴 定 技 术 规 程3 试 剂 、 材 料 和 仪 器 设 备3.1 试 剂霍 格 兰 氏 （ Hoagland） 营 养 液 ： 硝 酸 钙 945mg/L、 硝 酸 钾 607mg/L、 磷 酸 铵 115mg/L、 硫 酸 镁493mg/L、 铁 盐 溶 液 2.5mL/L、 微 量 元 素 5mL/L、 pH6.0， 无 菌 水 1L， 使 用 时 稀 释 20 倍 。铁 盐 溶 液 ： 七 水 硫 酸 亚 铁 2.78g、 乙 二
5、胺 四 乙 酸 二 钠 （ EDTA.Na） 3.73g、 无 菌 蒸 馏 水500mL、 pH5.5。微 量 元 素 液 ： 碘 化 钾 0.83mg/L、 硼 酸 6.2mg/L、 硫 酸 锰 22.3mg/L、 硫 酸 锌 8.6mg/L、 钼 酸 钠 0.25mg/L、 硫 酸 铜 0.025mg/L、 氯 化 钴 0.025mg/L。3.2 材 料（ a） 植 物 生 长 袋 （ 长 17.8cm， 宽 16.5cm） 、 （ b） 快 捞 夹 （ 长 29.8cm， 宽 23.3cm） 、 （ c） 快 捞架 （ 长 39.5cm， 宽 32.5cm） 、 （ d） 蛭 石 （ 2
6、0 目 ） 、 （ e） 培 养 钵 （ 高 11.5cm， 直 径 20cm） 。3.3 仪 器 设 备（ a） 孢 囊 分 离 筛 （ 20 目 、 100 目 、 200 目 、 500 目 ） 、 （ b） 移 液 器 （ 5mL） 、 （ c） 线 虫 孵 化 池 、（ d） 线 虫 计 数 板 、 （ e） 光 学 显 微 镜 （ 440 ） 、 （ f） 恒 温 光 照 培 养 箱 、 （ g） 高 压 蒸 汽 灭 菌 器 （ 121 、30min） 。4 室 内 空 气 环 境 与 培 养 条 件 4.1 室 内 空 气 环 境室 内 空 气 环 境 质 量 要 求 符 合 G
7、B 3095 的 规 定 。4.2 培 养 条 件 DB23/T 24762019 3 培 养 箱 调 至 光 周 期 为 16h 光 照 、 8h 黑 暗 、 白 天 温 度 28 、 夜 间 温 度 22 、 相 对 湿 度 70%的 循 环 程序 。5 鉴 定 材 料鉴 定 材 料 种 子 质 量 应 符 合 GB 4404.2 的 规 定 。6 育 苗 与 移 苗6.1 育 苗将 待 鉴 定 的 种 子 播 种 在 装 有 无 菌 蛭 石 的 培 养 钵 中 ， 每 钵 40粒 ， 常 规 管 理 。 3d 后 种 子 萌 发 出 幼 苗 ，剔 除 生 长 不 良 的 植 株 ， 保
8、留 生 长 一 致 的 30 株 幼 苗 备 用 。 6.2 移 苗（ a） 浸 湿 生 长 袋 。 向 直 立 的 生 长 袋 内 滤 纸 顶 端 夹 缝 内 加 入 无 菌 水 10mL， 使 生 长 袋 中 的 滤 纸 充 分 浸湿 且 生 长 袋 底 部 有 少 量 无 菌 水 存 留 。（ b） 移 苗 。 将 30 株 备 用 幼 苗 转 移 到 浸 湿 的 滤 纸 顶 端 夹 缝 内 ， 保 持 子 叶 高 于 生 长 袋 上 沿 ， 每 个 生 长袋 内 移 入 1 株 幼 苗 。（ c） 摆 放 。 每 2个 生 长 袋 放 入 1 个 快 捞 夹 中 ， 将 快 捞 夹 放
9、 到 快 捞 架 上 ， 每 个 快 捞 架 上 放 置 30个 快捞 夹 。7 培 养将 整 个 快 捞 架 置 于 培 养 箱 中 ， 每 三 天 浇 5mL霍 格 兰 氏 营 养 液 和 5mL无 菌 水 。 8 线 虫 接 种 液 制 备8.1 扩 繁 线 虫经 单 孢 囊 纯 化 的 孢 囊 群 体 接 种 在 感 病 品 种 根 部 土 壤 中 培 养 35d。8.2 收 集 孢 囊收 集 感 病 品 种 根 部 及 土 壤 中 的 孢 囊 ： 将 感 病 品 种 根 和 根 部 土 壤 放 入 盛 有 1/3清 水 的 1L烧 杯 中 ， 用玻 璃 棒 将 泥 水 混 合 物 剧
10、 烈 搅 拌 ， 静 置 1min 左 右 ， 将 上 清 液 依 次 倒 入 20目 和 100目 的 孢 囊 分 离 筛 中 。 用高 压 水 枪 冲 洗 20目 筛 子 上 的 感 病 品 种 根 、 土 壤 及 残 留 物 ， 将 落 入 100目 筛 子 上 的 孢 囊 冲 洗 至 烧 杯 中 ，用 置 于 漏 斗 架 上 的 单 层 滤 纸 （ 直 径 为 12.5cm） 过 滤 。 用 毛 笔 轻 轻 地 刷 分 布 于 滤 纸 边 缘 的 孢 囊 ， 收 集 后即 得 到 大 量 孢 囊 。8.3 分 离 线 虫 卵 将 收 集 的 孢 囊 转 移 到 200目 筛 子 上 ，
11、 下 面 套 500 目 筛 子 。 用 橡 皮 塞 在 200 目 筛 子 上 碾 磨 孢 囊 使 卵 释放 出 来 ， 高 压 水 枪 冲 洗 ， 收 集 落 于 500目 筛 子 上 的 卵 。8.4 线 虫 卵 孵 化将 线 虫 卵 悬 液 加 入 线 虫 孵 化 池 内 ， 置 于 恒 温 培 养 箱 （ 28 ， 黑 暗 ） 内 孵 化 45d， 收 集 孵 化 出 来 的二 龄 幼 虫 悬 浮 液 。 DB23/T 24762019 4 8.5 二 龄 幼 虫 接 种 液 制 备将 二 龄 幼 虫 悬 浮 液 注 入 线 虫 计 数 板 ， 于 光 学 显 微 镜 下 调 查 二
12、 龄 幼 虫 浓 度 ， 不 断 稀 释 使 线 虫 浓 度 调 至170条 /mL， 并 作 为 接 种 液 ， 备 用 。 大 豆 孢 囊 线 虫 不 同 生 理 小 种 二 龄 幼 虫 接 种 液 制 备 方 法 相 同 。9 接 种待 测 植 株 侧 根 生 长 至 5cm 左 右 （ 约 57d） ， 从 快 捞 夹 中 取 出 生 长 袋 ， 用 移 液 器 向 主 根 和 侧 根 及 其周 围 均 匀 滴 加 3mL 孢 囊 线 虫 二 龄 幼 虫 悬 浮 液 ， 将 接 种 后 的 生 长 袋 水 平 放 置 在 培 养 箱 中 ， 24h后 将 生 长 袋垂 直 放 在 快
13、捞 架 上 ， 置 培 养 箱 中 继 续 培 养 。 每 个 品 种 接 种 30 株 ， 每 10株 为 一 个 重 复 。10 调 查 培 养 至 21d后 将 生 长 袋 内 的 滤 纸 连 同 整 个 根 系 取 出 ， 调 查 每 株 根 系 孢 囊 数 量 。11 抗 性 评 价 方 法抗 性 评 价 方 法 应 按 NY/T3059执 行 ， 孢 囊 指 数 按 照 （ A.1） 计 算 ， 对 大 豆 孢 囊 线 虫 病 抗 性 评 价 标 准 见表 1， 鉴 定 调 查 表 参 见 附 录 表 A.1。 100 CTFI (A.1)FI-孢 囊 指 数 ； T-待 鉴 定
14、材 料 单 株 根 系 平 均 孢 囊 数 ； C-感 病 对 照 单 株 根 系 平 均 孢 囊 数 。表 1 对 大 豆 孢 囊 线 虫 病 抗 性 评 价 标 准 孢 囊 指 数 （ IP） 抗 性09% 抗 （ R）10%30% 中 抗 （ MR）31%60% 中 感 （ MS）60% 感 （ S） DB23/T 24762019 5 附 录 A（ 规 范 性 附 录 ）表 A.1 对 大 豆 孢 囊 线 虫 病 抗 性 鉴 定 调 查 表 日 期 ：编号 材 料 名 称 孢 囊 数 量 /株 孢 囊指 数(IP) 抗 性1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 平 均12 345678910111213 1415161718192021222324 252627282930 鉴 定 技 术 负 责 人 （ 签 字 ） ：
