1、ICS 11.220 B 41 DB22 吉林省地方标准 DB 22/T 30912019 鹿结核病病原菌实时荧光 PCR 检测方法 Real-time PCR method for the detection of Tuberculosis pathogenic organism in deer 2019 - 12 - 25 发布 2020 - 02 - 01 实施 吉林省市场监督管理厅 发布 DB22/T 30912019 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 和 GB /T 20001.4-2015 给出的规则起草。 本标准由吉林省畜牧业管理局提出并归口。 本标准起草单位：
2、吉林农业大学，中国农业科学院特产研究所。 本标准主要起草人：曾范利、李健明、时坤、宗颖、冷雪、赵丹、杜锐、徐超。 DB22/T 30912019 1 鹿结核病病原菌实时荧光 PCR 检测方法 1 范围 本标准规定了鹿结核病病原菌实时荧光PCR检测方法的试剂仪器、操作程序、结果判定。 本标准适用于梅花鹿、马鹿组织器官、血液中的结核分枝杆菌、牛分枝杆菌的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 1
3、9489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 27401 实验室质量控制规范 动物检疫 3 术语与定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 实时荧光 PCR Real -time PCR 一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质检测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。 3.2 Ct 值 cycle threshold 每个反应管内的荧光信号量到达设定的阈值时所经历的循环数。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 EDTA 乙二胺四乙酸（ethylene diam inetetraacetic acid） PBS 磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution）
4、5 原理 以 DNA 为模板进行PCR扩增，通过该反应，利用 荧光标记的特异性的探针，对 PCR 产物进行标记 跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件对产物进行分析，是否获得目的基因，并最终计算待测 样品模板的初始浓度。 6 试剂和材料 DB22/T 30912019 2 6.1 试剂 除另有说明，本方法仅使用分析纯试剂和重蒸馏水或符合 GB/T 6682 规定的一级水。 6.1.1 实时荧光 PCR 扩增所用的引物序列见表 1。 表1 引物序列 类别 核酸序列（5-3） 上游引物5-AGACCCCGGGACCTTCACTACAAC-3 下游引物5- AACGACTCCGCCCCAACTG
5、 -3 结核分枝杆菌 探针5-FAM- ACGGTTTGTGTAGGATAGGTGGGA-TAMRA-3 上游引物5- CGGGCGTTTTGTCGCATCC -3 下游引物5-GGGCGTGGGCAGACTTCGT-3 牛分枝杆菌 探针5-FAM-CTTGCGGAGGAGGTTGGGGACA TAMRA-3 6.1.2 动物血液与组织 DNA 提取试剂盒。 6.1.3 Taq 酶。 6.1.4 磷酸盐缓冲液（PBS）(0.01 mol /L,pH 7.4)。 6.1.5 0.5mol/L EDTA(pH 8.0)。 6.2 材料 6.2.1 离心管（50 mL、15 mL、1.5 mL）。
6、6.2.2 吸头（200 L1000 L、20 L200 L、2 L20 L、0.5 L10 L）。 6.2.3 荧光定量 PCR 管。 7 仪器设备 7.1 电子天平，感量 0.01 g。 7.2 荧光定量 PCR 仪。 7.3 台式低温高速离心机（4 ，13000 r/min）。 7.4 移液器（200 L1 000 L、20 L200 L、2 L20 L、0.5 L10 L）。 7.5 恒温水浴锅。 8 生物安全要求 采样、样品处理及检测过程所涉及的实验操作，应按 GB 19489 和 G B/T 27401 的有关规定执行。 9 操作步骤 9.1 样品的采集和保存 9.1.1 组织样品
7、的采集和保存 采集下颌、咽后、肺门、肠系膜淋巴结，肺，肝，脾等组织样品不少于 5 g。做好标识，置于密闭 容器内，冷冻或4 冷藏保存和运输。 DB22/T 30912019 3 9.1.2 血液样品的采集和保存 使用EDTA作为抗凝剂，无菌采集静脉血不少于 5 mL， 样品采集后于 2 8 冷藏保存，然后 立即运送实验室（夏季不超过 24 h，冬季不超过 2 d）。短时间不能送达的样品应于 -20 冷冻保存。 样品运送时应保持冷冻状态，不应反复冻融。 9.2 DNA 提取 按照商品化试剂盒说明书要求提取相应样品的 DNA。 9.3 对照样品 9.3.1 阳性对照 取结核分枝杆菌标准菌株灭活菌，
8、牛结核分枝杆菌灭活菌作为阳性对照。 9.3.2 阴性对照 取标准阴性样品作为阴性对照。 9.3.3 空白对照 去离子水。 9.4 扩增反应体系 结核分枝杆菌实时荧光 PCR 扩增反应体系见表 2。 表2 结核分枝杆菌实时荧光 PCR 反应体系 试剂 剂量 premix Ex TaqTM I (2） 13.5 l 上游引物(0.4 mol/L) 0.5 L 下游引物(0.4 mol/L) 0.5 L 探针（0.3mol/L） 1 L 待检 DNA 模板 2 L ddH2O 7.5 L Total 25 L 注： 上游、下游引物为结核分枝杆菌的引物。 DB22/T 30912019 4 牛分枝杆菌
9、实时荧光 PCR 扩增反应体系见表 3。 表3 牛分枝杆菌实时荧光 PCR 反应体系 试剂 剂量 premix Ex TaqTM I (2） 12.5 l 上游引物(0.3 mol/L) 0.5 L 下游引物(0.3 mol/L) 0.5 L 探针（0.2mol/L） 1 L 待检 DNA 模板 2 L ddH2O 8.5 L Total 25 L 注： 上游、下游引物为牛分枝杆菌的引物。 9.5 反应程序 结核分枝杆菌实时荧光 PCR 反应程序见表 4。 表4 结核分枝杆菌实时荧光 PCR 反应程序 反应步骤 时间/s 温度/ 第一步 30 95 5 95 第二步（40 个循环） 30 55
10、 注： 荧光收集设置在每次循环55 30 s时进行。 牛分枝杆菌实时荧光 PCR 反应程序见表 5。 表5 牛分枝杆菌实时荧光 PCR 反应程序 反应步骤 时间/s 温度/ 第一步 30 95 5 95 第二步（40 个循环） 30 60 注： 荧光收集设置在每次循环60 30 s时进行。 DB22/T 30912019 5 10 结果判定 10.1 质控标准 10.1.1 阳性对照 阳性对照的 Ct 值应35.0，并出现特定的扩增曲线。 10.1.2 阴性对照 空白对照、阴性对照无 Ct 值并且无扩增曲线。 10.1.3 有效原则 如阳性对照、阴性对照任意一项不满足以上条件，此次试验视为无效
11、。 10.2 结果描述与判定 10.2.1 阳性结果 待检样品能够扩增出结核分枝杆菌或牛分枝杆菌 S 型曲线，并且 Ct 值在预期的范围之内（ 35.0）判为核酸阳性。 10.2.2 阴性结果 检测结果呈现无 Ct 值并且无扩增曲线的反应判为核酸阴性。 10.2.3 可疑结果 对于 35Ct 值40 的样品，应进行重复试验。如果重复试验的 Ct 值40，且曲线有明显的对 数增长期，判为核酸阳性反应。 DB22/T 30912019 6 A A 附 录 A （规范性附录） 溶液配制 A.1 磷酸盐缓冲液（PBS pH 7.4）的配制 称取 8 g NaCl、 0.2 g KCl、1.44 g Na 2HPO4和 0.24 g KH 2PO4，溶于 800 mL 蒸馏水中，用盐酸 （HCl）调 pH至 7.4，定容至 1L ，采用 (1 212)/0.1 MPa高压下蒸气灭菌（至少 20 min），保存 于室温或 4 冰箱中。或按照商品化说明书配制。 A.2 0.5molL EDTA(pH 8.0) 的配制 称取186.1 g EDTA，加入800 mL 蒸馏水中，磁力搅拌器上剧烈搅拌，用氢氧化钠(NaOH)调pH至8.0， 定容至1 L，分装，采用(1212)/0. 1MPa，15 min高压灭菌后贮存于室温。 _
