1、 ICS 65.020.20 B 05 DB22 吉林省地方标准 DB 22/T 29872019 抗虫玉米 Bt 蛋白表达量检测技术规范 Technical specification for quantitative detection of Bt proteins in insect resistance maize 2019 - 05 - 27 发布 2019 - 06 - 17 实施 吉林省市场监督管理厅 发布 DB22/T 29872019 I 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由吉林省农业农村厅提出并归口。 本标准起草单位：吉林省农业科学院。 本
2、标准主要起草人：龙丽坤、夏蔚、李葱葱、刘娜、闫伟、董立明、邢珍娟、谢彦博、李飞武。 DB22/T 29872019 1 抗虫玉米 Bt 蛋白表达量检测技术规范 1 范围 本标准规定了抗虫玉米Bt蛋白表达量检测的总体要求、试验材料、试剂和材料、仪器设备、样品、 检测程序、结果判定与表述。 本标准适用于转Bt基因抗虫玉米环境安全评价中检测外源Bt蛋白含量ELISA技术的实施和运用。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 4404.1-2008 粮食作
3、物种子 第1部分：禾谷类 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 19495.1 转基因产品检测 通用要求和定义 GB/T 19495.2 转基因产品检测 实验室技术要求 GB/T 19495.8 转基因产品检测 蛋白质检测方法 农业部953号公告-10.1-2007 转基因植物及其产品环境安全检测 抗虫玉米 第1部分：抗虫性 农业部2031号公告-19-20 13 转基因植物及其产品成分检测 抽样 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 Bt 蛋白 Bt protein 来自苏云金芽孢杆菌（ Bacillus thuringiensis）由Bt基因表达的一类
4、杀虫蛋白。 3.2 ELISA enzyme linked immunosorbent assay 利用酶联抗体和底物形成有颜色反应的产物的一种定量分析方法，统称酶联免疫吸附分析。 3.3 检出限 limit of detection 样品中被稳定检出的最低蛋白含量或浓度。 3.4 定量限 limit of qua ntification 样品中被定量检出的最低蛋白含量或浓度。 3.5 变异系数 coeffici ent of variation 标准差与平均数的比值，用于衡量检测数据的离散程度。 4 总体要求 DB22/T 29872019 2 4.1 检测人员应具备转基因生物安全管理和检测
5、的相关知识，并在开展取样和检测工作前，接受相关 技术和业务知识培训。 4.2 检测实验室应符合 GB/T 1949 5.2 规定的要求。 4.3 检测过程应符合 GB/T 1949 5.1 规定的要求。 5 试验材料 5.1 受检材料为种植的待检测的玉米材料及受体对照材料。 5.2 种子质量应达到 GB 4404.1 -2008 中二级以上玉米种子要求。 5.3 种植和管理参照农业部 953 号公告-10.1-2007 的要求。 6 试剂和材料 6.1 除非另有说明，仅使用分析纯试剂和重蒸馏水或符合 GB/T 6682 规定的二级水。 6.2 根据待检 Bt 蛋白的类型，选用对应的 ELISA
6、 试剂盒，于保质期内验证试剂盒体系，并在有效期 内使用。试剂盒的定量限（LOQ）应不大于 0.1 g/ L 或 0.1 ng/g。 6.3 蛋白提取缓冲液可使用 ELISA 试剂盒中提供的，或根据需要可选择效果相当的提取缓冲液。 7 仪器设备 7.1 分析天平，感量 0.01 g。 7.2 酶标仪，波长范围 360 nm 640 nm。 7.3 超低温冰箱，-70 -80 。 7.4 低温离心机，4 、转速 4 000 g 10 000 g。 7.5 恒温培养箱，37 。 8 样品 8.1 取样 8.1.1 随机取样,每小区取样株数应不少于 10 株，同时采集同批待检测的玉米材料及受体对照材料
7、， 具体抽样数量和方法按照农业部 2031 号公告-19-2013 规定执行。 8.1.2 叶片、花丝、雌穗穗尖、茎秆、籽粒、根等玉米植株器官可作为蛋白检测的待测样品。 8.1.3 所采样品应单采单放，分别密封并置于恒定低温条件保存，避免污染。 8.2 样品制备 8.2.1 每个小区采集的样品分别在液氮中快速研磨成粉末，称取不少于 0.5 g。 8.2.2 按照 ELISA 检测试剂盒步骤，按一定的质量体积比加入蛋白提取缓冲液，制备样品蛋白溶液。 9 检测程序 9.1 一般要求 9.1.1 抗体、底物等的储藏条件和保质期应与生产商要求一致。 DB22/T 29872019 3 9.1.2 包括
8、标准蛋白在内，每个测试样品不少于 3 个平行。 9.2 标准曲线的制作 9.2.1 用蛋白提取缓冲液进行标准蛋白的稀释，不少于 6 个浓度梯度。 9.2.2 标准曲线相关系数 R 2 0.98。 9.3 试样检测 9.3.1 根据蛋白标准品确定检测范围，以蛋白提取缓冲液将样品溶液稀释到合适的分析浓度。 9.3.2 按照选定的 ELISA 试剂盒操作说明操作。 9.3.3 使用酶标仪测定相应波长下的光密度值（Optical densit y，OD），并读取样品试液中 Bt 蛋白 的浓度值。 9.4 主要参数要求 9.4.1 应以变异系数（CV）分析标准蛋白和阳性样品的平行间差异。标准曲线线性范围
9、内同一样品平 行间光密度值差异不得超过 15%， 所得浓度差异不得超过 20%。 如果超过 CV 百分数上限， 须重新检测。 9.4.2 应确定方法定量限（LOQ）和检出限（LOD）。 注： 可采用标准曲线中线性范围内最低标准蛋白浓度为方法 LOQ。可采用标准曲线最低浓度标准蛋白继续稀释的方 法确定 LOD，为光密度检测能达到不低于阴性对照 OD 值 2.1 倍的最低标准品浓度值，或选用其他有效确定 方法。 9.5 结果计算 大于或等于LOQ的样品试液浓度值，应按式（1）计算待测样品中的Bt蛋白含量。 1000 = X NY . (1) 式中： 待测样品中的Bt蛋白含量，单位为微克每克鲜重（
10、g/g 鲜重）； Y 试液中的蛋白浓度，单位微克每升（ g/L）； N 样品溶液的稀释倍数； X 样品溶液的质量体积比，单位克每毫升（g/mL）。 注： 计算结果保留两位小数。 应采用统计学方法计算各小区样品的外源Bt蛋白含量平均值（ ）和标准差（S），外源Bt蛋白含 量表示为（ S）g/g 鲜重。 10 结果判定与表述 按表 1进行结果判定和表述。 DB22/T 29872019 4 表1 结果判定和表述 样品试液测定值 结果判定与表述 YLOQ 样品中检测出Bt 蛋白，含量为（ S）g/g 鲜重。 YLOQ，且 YLOD 样品中检测出Bt 蛋白，含量低于方法定量限。 YLOD 样品中未检测出Bt 蛋白。 _
