1、 ICS 11.220 B 41 DB22 吉林省地方标准 DB 22/ T 29152018 供血犬血液检测技术要求 Technical request for canine blood detection 2018 - 11 - 12 发布 2018 - 12 - 30 实施 吉林省市场监督管理厅 发布 DB22/T 29152018 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.12009 给出的规则起草。 本标准由吉林省畜牧业管理局提出并归口。 本标准起草单位：长春工业大学、长春西诺生物科技有限公司。 本标准主要起草人：殷玉和、石晶、罗国良、吴丛梅、高冷、刘伟、陈宪平。 DB22/T 2915
2、2018 1 供血犬血液检测技术要求 1 范围 本标准规定了供血犬血液的术语和定义、技术要求和检测方法。 本标准适用于供血犬血液的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 中华人民共和国兽药典2015版三部 中华人民共和国药典2015版四部 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 供血犬 canine for blood 提供血源来源的健康犬。 3.2 犬血制品 canine bloo d products 以供血犬血液为原料，采用生
3、物学工艺或分离纯化技术制备的生物活性制剂。 3.3 犬血清 canine serum 供血犬血液凝固后，在血浆中除去纤维蛋白原，分离出的淡黄色澄明液体。 4 技术要求 4.1 性状 4.1.1 供血犬血液 应为鲜红色或暗红色混悬、黏稠液体。 4.1.2 犬血清 应为淡黄色或黄色澄明液体，无溶血、无乳糜及可见异物。 4.2 犬血清 pH 值 应为7.2 8.2。 4.3 犬血清渗透压摩尔浓度 应为210 mOsmol/k g 400 mOsmol/kg。 DB22/T 29152018 2 4.4 犬血清细菌内毒素含量 应小于 10 EU/mL。 4.5 犬血清蛋白质含量 应不低于 50.0 m
4、g/mL。 4.6 犬血清外源病毒 致细胞病变检查、 红细胞吸咐检测应为阴性， 荧光抗体检查犬瘟热病毒 （CDV） 、 狂犬病病毒 （RABV） 、 犬腺病毒（CAV）和犬细小病毒（CPV）均应为阴性。 5 检测方法 5.1 性状检查 视觉感官观察。 5.2 pH 值测定 将供血犬血液分离出血清，按照附录 A 测定。 5.3 渗透压摩尔浓度测定 将供血犬血液分离出血清，按照附录 B 测定。 5.4 细菌内毒素含量检测 将供血犬血液分离出血清，按照附录 C 测定。 5.5 蛋白质含量检测 将供血犬血液分离出血清，按照附录 D 测定。 5.6 外源病毒检测 将供血犬血液分离出血清，按照附录 E 测
5、定。 DB22/T 29152018 3 附 录 A （规范性附录） pH 值测定 A.1 检测方法 检验依据 2015版中华人民共和国兽药典三部附录3101。 A.2 实验物品 A.2.1 仪器 酸度计，应以玻璃电极为指示电极，饱和甘汞电极为参比电极的酸度计进行测定。 A.2.2 校正用标准缓冲液 A.2.2.1 磷酸盐标准缓冲液，pH 6.86（25 ） 。 A.2.2.2 硼砂标准缓冲液，pH 9.18 （25 ） 。 A.3 实验操作 A.3.1 样品测定前，取校正用缓冲液对仪器进行校正,见表A.1，使仪器示值与表列数值一致。 A.3.2 仪器校正后，用硼砂标准缓冲液核对仪器示值，误差
6、应不大于0.02 pH值单位。如果大于此偏 差，则应小心调节斜率，使示值与第二种标准缓冲液的表列数值相符。重复上述定位与斜率调节操作， 至仪器示值与标准缓冲液的规定数值相差不大于0.02 pH值单位。 A.3.3 样品应置小烧杯中，取样后应当立即测定，以免空气中的CO2影响测定结果。 A.3.4 每次更换检测样品时，应用纯化水充分洗涤电极，然后将水吸尽。 表A.1 不同温度标准缓冲液 pH 值对照表 温度（） 磷酸盐标准缓冲液 硼砂标准缓冲液 0 6.98 9.64 5 6.95 9.40 10 6.92 9.33 15 6.90 9.28 20 6.88 9.23 25 6.86 9.18
7、30 6.85 9.14 35 6.84 9.10 DB22/T 29152018 4 A.4 结果判定 供血犬血液血清pH值应为7.2 8.2，在此范围判定为合格，超出此范围判为不合格。 DB22/T 29152018 5 A B 附 录 B （资料性附录） 渗透压摩尔浓度测定 B.1 检测方法 检验依据根据2015版中华人民共和国药典四部通则0632。 B.2 实验物品 B.2.1 仪器 渗透压摩尔浓度测定仪。 B.2.2 校正用标准缓冲液 取基准氯化钠试剂，于 500 650 干燥 40 min50 min，置干燥器（硅胶）中放冷至室温。 根据需要按表 B.1中所列数据精密称取适量，溶于
8、 1 kg 水中，摇匀，即得。 表B.1 渗透压摩尔浓度测定仪校正用标准溶液 每 1 kg 水中氯化钠的重量/g 毫渗透压摩尔浓度/mOsmol/kg 冰点下降温度/T/ 3.087 100 0.186 6.260 200 0.372 9.463 300 0.558 12.684 400 0.744 15.916 500 0.930 19.147 600 1.116 22.380 700 1.302 B.3 实验操作 取适量新沸放冷的水调节仪器零点，由表中选择两种标准溶液（供试品溶液的渗透压摩尔浓度应介 于两者之间）校正仪器，再测定供试品溶液的渗透压摩尔浓度或冰点下降值。 B.4 结果判定 供
9、血犬血液血清部分渗透压摩尔浓度应为210 mOsmol/kg40 0 mOsmol/kg，在此范围判定为合格， 超出此范围判为不合格。 DB22/T 29152018 6 B C 附 录 C （规范性附录） 细菌内毒素检验操作规程 C.1 检测方法 检验依据2015版中华人民共和国兽药典第一部附录1143。 C.2 试剂 C.2.1 鲎试剂 灵敏度0.125 EU/支，2 8 保存，有效期为 12 个月。 C.2.2 细菌内毒素工作标准品（CSE） 系细菌内毒素工作标准品中每1 ng细菌内毒素的效价不小于2 EU，不大于50 EU。 C.2.3 细菌内毒素检查用水 系指与灵敏度为 0.03 E
10、U/mL或更高灵敏度的鲎试剂在 37 1 条件下 24 h不产生凝集反应 的灭菌注射用水。 C.3 仪器设备 C.3.1 电热鼓风干燥箱。设备验证合格，仪表校验合格，并在有效期内。 C.3.2 电热恒温水浴箱。校验合格并在有效期内。 C.3.3 水银温度计。温度范围 -30 100 1 。 C.3.4 旋涡混悬器。 C.3.5 玻璃反应管（10 mL） 。洗刷后用 4% 氢氧化钠浸泡除热原，250 干热灭菌 120 min。 C.3.6 其他试验用品。0.2 mL及 1 mL 移液器、一次性无热原吸头、封口膜、定时钟、剪刀、砂轮片、 75%酒精棉球。 C.4 实验操作 C.4.1 待检样品稀释
11、 待检样品检测，选用鲎试剂灵敏度 0.125 EU，稀释80倍检测。取原液先10倍稀释，然后倍比稀 释至 80 倍稀释液，备用。 C.4.2 2 细菌内毒素溶液的稀释 取细菌内毒素工作标准品，用细菌内毒素检查用水稀释为2 细菌内毒素溶液，备用。 DB22/T 29152018 7 C.5 样品检测 取鲎试剂 8 支，其中样品2支，阴性对照 2 支，阳性对照2支，供试品阳性对照 2 支，各加入 0.1 mL溶解水溶解，然后，样品管加最大稀释倍数的样品溶液 0.1 mL，阳性管加入0.1 mL 2 内毒素标准 品液，供试品阳性对照管加 0.1 mL 2 的供试品溶液，轻轻摇匀，8 支管放入37 1
12、 水浴保温 1 h，观察结果。 C.6 结果判定 将试管轻轻从水浴中取出，缓缓倒转 180 ，管内凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阳性（+），凝 胶不能保持完整，并从管壁滑脱者为阴性（-），样品管均为阴性判定为符合规定，如两管均为阳性判 定为不合格，如样品管 1 管为阳性 1 管为阴性，按上述方法另取 4 支复试，若 4 支管 1 管为阳性， 则认为不符合规定，阳性对照管为阴性，阴性对照管为阳性，试验无效，保温和拿取试管过程中应避免 受到振动造成假阳性。结果为阳性时，即表示细菌内毒素含量大于等于 10 EU/mL，判定为不合格。 DB22/T 29152018 8 C D 附 录 D （规范性附录
13、） 蛋白质含量检验 D.1 检测方法 检验依据2015版中国药典四部通则0731蛋白质测定法 双缩脲法。 D.2 实验物品 D.2.1 试剂 D.2.1.1 双缩脲试剂 取硫酸铜 3.0 g、酒石酸钾钠 9.0 g、碘化钾 5.0 g 、氢氧化钠 24.0 g，加水溶解并稀释至 1000 mL，摇匀，即得。 D.2.1.2 标准蛋白质溶液 精密量取牛血白蛋白标准品适量，用 0.9% 氯化钠溶液定量稀释成每 1 mL含 50 mg的溶液。 D.2.2 仪器设备 D.2.2.1 紫外分光光度计。 D.2.2.2 电热恒温水浴箱。校验合格并在有效期内。 D.2.2.3 旋涡混悬器。 D.2.2.4
14、玻璃反应管。10 mL。 D.2.2.5 玻璃试管，吸管（5 mL） ，吸耳球，玻璃比色皿。 D.2.2.6 其他试验用品。1 mL 移液器、定时钟。 D.3 实验操作 D.3.1 供试品溶液，精密量取适量的供试品，加水制成每 1 mL约含 50 mg的溶液。 D.3.2 分别精密量取供试品溶液与标准蛋白质溶液各 0.5 mL置 玻璃试管中，分别加双缩脲试剂 4.0 mL，混匀，置 37 水浴中 30 min。 D.3.3 按照紫外-可见分光光度法，在波长 540 nm 处检测吸光度。另精密量取水 0.5 mL，自“加双 缩脲试剂 4.0 mL”起，同法操作，作为空白对照。 D.4 结果计算公
15、式 2 1 A ncA B . (D.1) DB22/T 29152018 9 式中： B 为 蛋白质含量，mg/mL； 1 A 为供试品溶液的吸光度； 2 A 为标准蛋白质溶液的吸光度； c为标准蛋白质溶液的浓度，mg/mL； n为供试品稀释倍数。 DB22/T 29152018 10 D E 附 录 E （规范性附录） 外源病毒检验 E.1 实验物品 E.1.1 细胞 Vero、NA、MDCK 和 F81细胞。 E.1.2 病毒 犬瘟热病毒(CDV)、狂犬病病毒(RABV)、犬腺病毒(CAV)和犬细小病毒(CPV)。 E.1.3 试剂 犬瘟热病毒荧光抗体、狂犬病病毒荧光抗体、犬腺病毒荧光抗
16、体和犬细小病毒荧光抗体。 E.1.4 设备 倒置荧光显微镜，二氧化碳培养箱。 E.1.5 器材 T25细胞培养瓶，10 Ml 移液吸管，6 孔细胞培养板。 E.2 实验操作 E.2.1 样品的处理 将待检血液自然凝固后，以 2000 g3000 g离心 10 min，分离出血清，如为无菌采取的血清，可 直接作为检品，如采取过程可能污染，应将血清用 0.22 um滤器过滤除菌后作为检品。 E.2.2 细胞的准备 E.2.2.1 开启生物安全柜或超净工作台，运行 10 min。 E.2.2.2 准备好细胞培养瓶和离心管，加入 7 mL细胞培养液。 E.2.2.3 佩戴眼镜和手套，从液氮罐中取出安瓿
17、或冷冻管，迅速放入 38 水浴中，并不时摇动，在1 min内使其完全融化。 E.2.2.4 将冻存管用 75% 酒精棉擦拭 2 遍，用吸管在无菌下取出细胞，缓慢加入含细胞培养基的离 心管内，在 1000 r/min速度下离心5 min10 min，弃去上清。 E.2.2.5 用移液管吸取培养瓶内培养基 2 mL至沉淀中，轻轻吹打均匀，将细胞悬液加入装有培养基的 培养瓶中，置 37 二氧化碳培养箱中静置培养，观察生 长情况。培养 3 d5 d，细胞长成致密单层 时，及时传代。 E.2.2.6 细胞传代：将原瓶中的细胞培养液倾倒干净或用吸管吸弃，加入适量PBS清洗细胞生长面，倒 去PBS，加入适量
18、消化液（一般情况下，T25培养瓶不超过 0. 5 mL0.8 mL；T75培 养瓶 1.0 mL1.5 DB22/T 29152018 11 mL） ，轻晃消化液，使其浸湿整个细胞面，将细胞平放温箱内或室温下消化。当观察到细胞面发白、局 变出现针孔空隙或裂隙时，轻拍细胞面后立即加入少量细胞培养液中止消化，用吸管轻柔吹打细胞至细 胞成分散良好的均匀混悬液，确保培养瓶底的每个角落都吹打下来，吹打时尽量避免产生气泡。按照1: 31:5比例进行传代。用吸管将混合均匀的细胞悬液均分至细胞培养瓶内，补足细胞培养液，盖好细胞 瓶盖，轻轻晃匀细胞悬液，平放置培养箱中培养。 E.2.3 样品的接种与培养 E.2
19、.3.1 取处理好的样品，分别吸附接种到已长成良好单层的MDCK、Vero和NA细胞的T25细胞瓶各1瓶， 同时同步接种F81细胞T25细胞瓶1瓶，每瓶接种 1 mL ,另分别设1瓶正常细胞对照，培养 3 d5 d，每 日观察细胞生长情况，继代至少 2 代。 E.2.3.2 最后一次继代（至少为第3代）时，每种培养物传出3组培养物：3组T25培养瓶，用于致细胞 病变检查和红细胞吸附检查，1组6孔板培养物，用于荧光抗体检测。 E.2.3.3 如果样品传代培养期间，任何一代培养细胞出现细胞病变，而正常细胞未出现病变，则判为 阳性。当被检样品判为阳性时，不再进行其他项目检验。 E.2.4 致细胞病变
20、检查和红细胞吸附检查用细胞培养物的接种培养 取样品进行最后一次继代时，取上一代经 2 次冻融的 培养物吸附接种 已长成 70%-80% 细胞单层 MDCK、Vero和NA细胞各 3 瓶，同步接种F81细胞3瓶，每瓶接种1 mL，吸附接种的细胞于37 吸附1 小时后，补加含2%牛血清的MEM营养液，并设正常Vero、NA、F81和MDCK细胞对照各 3 瓶，置 37 培 养箱培养 3 d5 d，每日观察细胞病变情况。 E.2.5 荧光抗体检查用细胞培养物接种培养 取样品进行最后一次继代时， 取上一代经 2 次冻融的培养物吸附接种已长成 70%-80% 细胞单层的 6孔Vero细胞板（检测CDV）
21、、MDCK细胞板（检测CAV）、NA细胞培养板（检测RABV）各1块，同时同步接 种 F81细胞板（检测CPV）1 块，每块板接种 2 孔， 每孔200 L，同时将CDV阳性对照毒株、CAV阳性 对照毒株、RABV阳性对照毒株，CPV阳性对照毒株稀释为100 TCID 50300 TCID50, 分别吸附接种6孔Vero 细胞板、MDCK细胞板、NA细胞培养板，同步接种F81细胞板，每块板接种2孔，每孔200 L，并设正常 细胞对照 2 孔，置37培养箱培养 3 d5 d。 E.2.6 致细胞病变检查 将E.2.4接种的一组细胞培养瓶弃去培养液，用 PBS 洗涤 3 遍，加入 2 mL 姬姆萨
22、染色液，室温 下染色 15 min30 min，然后用PBS洗涤3次，置显微镜检查单层细胞，观察包涵体、巨细胞异常和其 他由病毒引起的细胞病变（CPE）是否存在，当正常对照细 胞未出现CPE，而被检样品出现CPE，则判为 阳性，不再进行其他项目检验。 E.2.7 红细胞吸附检查 将E.2.4接种的另二组细胞培养瓶弃去培养液， 用无钙镁离子的PBS洗涤 3 遍，向每一细胞培养瓶 中加入2 mL 0.2%的豚鼠红细胞和0.5%猪红细胞的等量混合物，将培养瓶同时在 2 8 和20 25 放置 30 min，然后用无钙镁离子的PBS洗涤 3 次，用 30 倍60 倍显微镜检查吸附情况。 当正常对照细胞
23、不出现红细胞吸附现象，而被检样品出现红细胞吸附现象，则判为阳性，不再进行其他 项目检验。 E.2.8 荧光抗体检查 DB22/T 29152018 12 E.2.8.1 洗涤 将E.2.5接种的细胞培养板弃去培养液，用无钙镁离子 PBS洗涤 2 次3 次。每次洗涤时，每孔加 入 5 mL PBS, 室温孵育 3 min5 min，弃去PBS。 E.2.8.2 固定 每孔加入 2 mL冰预冷的80%丙酮溶液，2 8 冰箱固定 30 min,PBS洗板 5 次，晾干。 E.2.8.3 加入荧光抗体 向孔中加入对应的荧光抗体工作液， 使其覆盖于细胞表面， 置于不透光湿盒中， 37 作用 60 min
24、， 弃去荧光抗体，用 PBS 洗板 5 次，自然晾干。 E.2.8.4 终止反应 用 50% 甘油封片剂封片，置于荧光显微镜下进行观察。 E.2.8.5 判定标准 对于犬瘟热病毒（CDV）、犬腺病毒（CAV）和狂犬病毒(RABV)：阳性对照孔应出现典型的特异性胞 浆内黄绿色荧光，细胞对照孔未出现特异性黄绿色荧光时，试验成立。如待检细胞孔出现特异性胞浆内 黄绿色荧光，则判为阳性，否则判为阴性。 对于犬细小病毒(CPV)：阳性对照孔应出现典型的特异性胞核内黄绿色荧光，细胞对照孔未出现特 异性黄绿色荧光时，试验成立。如待检细胞孔出现特异性胞核内黄绿色荧光，则判为阳性，否则判为阴 性。 如果阳性对照未出现特异性荧光，或者正常细胞出现特异性荧光，实验不成立，应重做。 E.3 结果判定 当细胞培养中CPE检查、致细胞病变检查、红细 胞吸附检查、荧光抗体检查中任一项或多项为阳性 时，外源病毒检查即为阳性，仅当以上检查全部为阴性时，外源病毒检查为阴性。 _
