1、 ICS 07.100.10 C 04 DB22 吉林省地方标准 DB 22/T 2432019 代替 DB 22/T 243-2000 霍乱弧菌检测 气相色谱-质谱法 Method of Vibrio cholera With Gas chromatography-mass spectrometry 2019 - 10 - 14 发布 2019 - 11 - 01 实施 吉林省市场监督管理厅 发布 DB22/T 2432019 I 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009 和GB /T 20001.4-2015给出的规则修订。 本标准代替 DB22/T 243-2000气相色谱- 质谱检
2、测霍乱弧菌的方法。与 DB22/T 243-2000 相比， 除编辑性修改外主要技术变化如下： 修改标准名称为霍乱弧菌检测 气相色谱 -质谱法； 在“规范性引用文件”中，增加了GB/T 6682和 GB 19489（ 见2）；删除了GB 159 84-1995 ； 增加了“原理”（见3）； 修改了“试剂和材料”（见4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6，2000年版的 3）； 增加了“标准菌株”（见4.11）； 增加了“材料”（见4.17）； 增加了“恒温培养箱”（见5.9）； 增加了“级生物安全柜”（见5.10）； 增加了“样品分离培养方法”（见 6.1）； 修改了“色谱条件”（见
3、7.3.1， 2000 年版的 4.1）； 修改了“进样方式”（见 7.3.1.6， 2000 年版的 5.3）； 增加了“质量保证”（见 9）； 增加了“废弃物的处理”（见 10）； 增加了“试验报告”（见 11）。 本标准由吉林省卫生健康委员会提出并归口。 本标准修订单位：吉林省疾病预防控制中心。 本标准主要修订人：杨修军、张炜煜、崔勇、张立夫、姚佳彤。 本标准的历次版本发布情况为： DB22/T 243-2000。 DB22/T 2432019 1 霍乱弧菌检测 气相色谱-质谱法 警示使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验，本标准并未指出所有可能的安全问 题，使用者有责任采取适当的
4、安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。 1 范围 本标准规定了霍乱弧菌气相色谱-质谱检验方法。 本标准适用于病例样本和环境样本中霍乱弧菌的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室生物安全通用要求 3 原理 气相色谱是一种以气体为流动相，采用冲洗法的柱色谱分离技术，并与适当的鉴定手段相结合的一 种分析方法。不同菌属或同属不同血清型细菌全细胞脂肪酸组成成分不同，它们
5、有各自不同的色谱-质 谱指纹图，根据峰值不同进行判断。根据霍乱弧菌种共有特异性峰值判断可检出羟基十四烷酸甲酯 （C15H30O3）、油酸甲酯（C18H34O2）、亚油酸甲酯 （C18H32O2）和异硬酯酸甲酯（ C19H38O2）。霍乱 弧菌埃尔托生物型稻叶血清型菌株细胞脂肪酸-十六烯酸甲酯（C17 H32O2）进行霍乱弧菌埃尔托生物 型稻叶血清型和埃尔托生物型小川血清型区别。 4 试剂和材料 除另有规定外，所有试剂均为分析纯。实验室用水符合 GB/T 6682中一级水的要求。 4.1 甲醇：色谱纯。 4.2 氢氧化钾：色谱纯。 4.3 正庚烷：色谱纯。 4.4 氯化钠：色谱纯。 4.5 无水
6、硫酸钠：色谱纯。 4.6 石油醚：色谱纯（60 90 ）。 4.7 甲醇-甲苯-硫酸溶液（30+15+1） 4.8 三氟化硼-甲醇溶液（15+85）。 4.9 氦气。 4.10 生理盐水。 DB22/T 2432019 2 4.11 标准菌株: a) 埃尔托生物型小川血清型 CMCC18514； b) 埃尔托生物型稻叶血清型 CMCC18512。 4.12 庆大霉素琼脂培养基。 4.13 碱性蛋白胨水。 4.14 TCBS 培养基。 4.15 大豆胰酶解酪蛋白肉汤培养基。 4.16 氮气 4.17 材料： a) 有机滤膜(碳酸氢钠)，0.22 m； b) 毛细柱(中等极性)，30 m0.25
7、mm0.25 m； c) 皂化瓶：50 mL； d) 离心管：10 mL； e) 离心管：1.5 mL； f) 玻璃安瓶。 5 仪器和设备 5.1 气相色谱-串联质谱仪：EI 源。 5.2 电子分析天平：感量 0.1 mg。 5.3 离心机：最低转速不低于 12000 r/min。 5.4 氮吹仪。 5.5 涡旋混合器。 5.6 恒温水浴箱。 5.7 真空冷冻干燥机。 5.8 麦氏比浊仪。 5.9 恒温培养箱（36 1 ）。 5.10 级生物安全柜。 5.11 微量可调移液器及配套带滤芯吸头（100 L）。 6 样品 6.1 样品分离培养 将样本（5.10）及标准菌株（4.11 a和4.1 1
8、 b）接种到碱性蛋白胨水（4.13）36 1 增菌培 养（5.9）6 h8 h后，从菌膜下表层取 1 接种环接种于庆大霉素培养基（4.12）上36 1 培养 18 h24 h；必要时进行 2 次增菌培养。从分离培养基上 挑取疑似菌落接种于TCBS培养基（4.14）进 行纯培养，36 1 ，18 h24 h。用生理盐水(4.10)制备1麦氏单位（5.8）菌悬液10 mL，80 ， 30 min（5.6）灭活。从灭活菌悬液中吸取（5.1 1）100 uL无菌菌液接种到大豆胰酶解酪蛋白肉汤培养 基（4.15）中，37 培养18 h24 h，无菌生长。 6.2 冻干菌粉的制备 将灭活后菌悬液离心（5.
9、3）12000 r/min,5 min，弃上清取沉淀，真空冷冻干燥（5.7）。 DB22/T 2432019 3 7 试验步骤 7.1 酸甲酯化 将冻干灭活菌粉5 mg放入玻璃安瓶（4.17 f）中，加入1 m L甲醇一甲苯硫酸(30+15 +1)(4.7)混 匀，熔封安瓶。在80 水浴(5.6)水解酯化18 h，冷却后加入2 mL石油醚(4.6)离心，取上层提取液通 过碳酸氢钠过滤器(4.17 a)过滤，滤液用氮气(5.4)吹干后， 加0.5 mL的正庚烷(4.3)溶解。 7.2 碱甲酯化 取冻干灭活菌粉5 mg于皂化瓶（4.17.c）中加4 mL 0. 5 mol/L 氢氧化钾（4.2）-
10、甲醇（4.1）溶 液，皂化瓶中连接冷凝管，并向瓶中通入氮气（ 4.16），在60 水浴上反应20 min冷却后，从冷凝管 的上口加入4 mL三氟化硼一甲醇溶液(4.8)反应2 min，取下皂化瓶加入2 mL正庚烷(4.3)混合1 min，先 加入少量的饱和氯化钠(4.4)水溶液，混匀后，再加大量的饱和氯化钠水溶液液至瓶口，将上清液用无 水硫酸钠(4.5)脱水后，移入1.5 mL离心管( 4.17 e)中，用氮气吹至0.5 mL。 7.3 仪器参考操作条件 7.3.1 色谱条件 7.3.1.1 色谱柱：30 m0.25 mm0.25 m。 7.3.1.2 柱温：80 。以 10 升温 250 并
11、保持 10 min。 7.3.1.3 进样口温度 230 ，检测温度 250 ，柱流量 2 mL/min；分流比 5:1。 7.3.1.4 色谱质谱接口温度 280 ，载气为氦气（4.4），流量为 1.0 mL/min。 7.3.1.5 进样量为 1.0 L。 7.3.1.6 进样方式 ：为无分流进样，1 min 后开阀。 7.3.2 质谱条件 7.3.2.1 电离方式 电子轰击源（EI）；电离能量70 eV。 7.3.2.2 离子监测方式 全扫描方式。 8 试验数据处理 8.1 结果判定 8.1.1 检出羟基十四烷酸甲酯（C 15H30O3）、油酸甲酯（C 18H34O2）、亚油酸甲酯（C
12、18H32O2）和异硬酯酸甲 酯（C 19H38O2）特异性峰，判定为“霍乱弧菌”。 8.1.2 检出十六烯酸甲酯（C 17H32O2）特异性峰，判定为霍乱弧菌埃尔托生物型稻叶血清型，而非霍乱 弧菌埃尔托生物型小川血清型。 9 质量保证 9.1 空白对照 DB22/T 2432019 4 用生理盐水做实验空白。 9.2 阳性对照 9.2.1 埃尔托生物型稻叶血清型 CMCC18514，参见附录 A 图 A.1。 9.2.2 埃尔托生物型小川血清型 CMCC18512，参见附录 A 图 A.2。 10 废弃物处理 按GB 19489规定执行。 11 试验报告 试验报告至少应给出以下几个方面内容： a) 试验对象； b) 所使用的标准（包括发布或出版年号）； c) 所使用的方法（如果标准中包括几个方法）； d) 结果； e) 观察到的异常现象； f) 试验日期。 DB22/T 2432019 5 A A 附 录 A （资料性附录） 霍乱弧菌标准菌株细胞脂肪酸酸气相质谱指纹图谱 2 种霍乱弧菌标准菌株细胞脂肪酸酸气相质谱指纹图谱见图A.1 和图A.2。 图A.1 图A.2 _
