1、ICS 11.220 B 41 DB21 辽宁省 地 方 标 准 DB21/T 3253 2020 小反刍兽疫病毒实时荧光 RT-PCR 检测方法 Development the method of real-time fluorescent RT-PCR for detection of PPRV 2020 - 04 - 30 发布 2020 - 05 - 30 实施 辽宁省市场监督管理局 发布 DB21/T 3253 2020 I 目 次 前 言 .II 1 范围 .1 2 规范性引用文件 .1 3 缩略语 .1 4 原理 .1 5 仪器和器材 .1 6 试剂和引物 .2 7 操作步骤 .
2、2 8 试验成立条件与结果判定 .4 9 检测过程中防治交叉污染的措施 .4 10 废弃物处理 .5 DB21/T 3253 2020 II 前 言 本标准按照 GB/T 1.1 2009 给出的规则起草。 本标准由 动物卫生标准化技术委员 会（辽宁）提出 。 本标准由辽宁省农业农村厅归口。 本标准起草单位： 辽宁省农业发展服务中心、洛阳莱普生信息科技有限公司、辽宁佰瑞生物科技有 限公司。 本标准主要起草人： 邓文超、石霖、魏园园、吴继阳、张皓淳、王冰、张 鑫、王竹、刘金玲、董娜、 高原、 杨作丰 、彭潇潇、姚伟、里里、陈腾、胡影。 本标准发布实施后，任何单位和个人如有问题和意见建议，均可以通
3、过来电和来函等方式进行反馈， 我们将及时答复并认真处理，根据实际情况依法进行评估及复审。 归口管理部门通讯地址：辽宁省农业农村厅（沈阳市和平区太原北街 2号），联系电话： 024-23447862； 标准起草单位通讯地址：辽宁省动物及产品检疫中心（沈阳市沈河区万柳塘路 105号甲），联系电 话： 024-24229579。 DB21/T 3253 2020 1 小反刍兽疫病毒实时荧光 RT-PCR 检测方法 1 范围 本标准规定了 小反刍兽疫 病毒实时荧光 RT-PCR检测方法的技术要求。 本标准适用于在生物安全 级（ BSL-2）以上的实验室进行 小反刍兽疫 病毒病的诊断、监测及流行 病学调
4、查，适用于 反刍动物 血液血清、 淋巴结 及 口鼻棉拭子 中 小反刍兽疫 病毒核酸的 RT-PCR检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日 期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 19495.2-2004 转基因产品检测 实验室技术要求 中华人民共和国农业部公告第 302号（兽医实验室生物安全技术管理规范） 农业部关于印发病死及病害动物无害化处理技术规范的通知（农医发 201725号） 3 缩略语 下列缩略语适用于本标准。 PPRV： 小反刍兽疫 病毒（ Peste des
5、Petits Ruminants virus） RNA：核糖核酸（ ribonucleic acid） RNase：核糖核酸酶（ ribonuclease） DEPC：焦炭酸二乙酯（ diethylpyrocarbonate） bp：碱基对（ base pair） RT-PCR：反转录聚合酶链式反应（ reverse transcription polymerase chain reaction） dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（ deoxy-ribonucleoside triphosphate） PBS：磷酸盐缓冲液（ phosphate buffer solution） TAE：三羟甲基氨
6、基甲烷 -乙酸电泳 缓冲液（ Tris acetate-EDTA buffer） 4 原理 本方法 针对 小反刍兽疫 病毒高度保守区域设计特异性引物和探针，在反应体系中含 小反刍兽疫 病毒 基因组模板的情况下， PCR 反应得以进行并释放荧光信号。利用仪器对 PCR 过 程中相应通道的信号强 度进行实时监测和输出，实现检测结果的定性分析。 5 仪器和器材 5.1 台式冷冻离心机 （离心范围 0 20000r/min） 5.2 冰箱： 4 1， -20 1， -80 1 DB21/T 3253 2020 2 5.3 全自动荧光定量 PCR 仪（ ABI7000、 ABI7300、 ABI7500
7、、 ABI7900、 BIO-Rad CFX384Touch、 BIO-Rad CFX96Touch 等） 5.4 离心管： 15 mL、 1.5 mL 和 0.2 mL。 5.5 微量可调移液器： 100 1000 L， 20 200 L， 10 100 L， 5 50 L， 2 20 L， 0.5 10 L， 0.2 2 L。 6 试剂和引物 6.1 RNA 抽提试剂： Trizol 外观为淡粉色，于 4 8保存。 6.2 氯仿： -20预冷。 6.3 异丙醇： -20预冷。 6.4 DEPC 水：去离子水中加 入 0.1%DEPC， 37作用 1h 或室温过夜， 121 1高压灭菌 15
8、 min。 6.5 75%乙醇：用无水乙醇和 DEPC 水配制， -20预冷。 6.6 阳性对照： PPRV 细胞培养物。 6.7 阴性对照：灭菌水。 6.8 Prime ScriptTM one Step RT-PCR kit Ver.2 试剂盒。 6.9 PBS：磷酸盐缓冲液（ 0.02 mol/L pH7.2）。 6.10 引物：用于 RT-PCR 反应的引物浓度为 20 mol/L。 注：本 标准 中使用的试剂，除另有说明外，所有实验使用的试剂等级均为不含 RNA或 RNase的分析纯或生化试剂； 所有试 剂均用 无 RNA酶污染的无菌 的容器分装。 7 操作步骤 7.1 采样与样品的
9、前处理 7.1.1 口鼻棉拭子样品 采样时要将拭子深入 口腔、 鼻腔来回刮 35 次，取 口腔、 鼻腔分泌液，将拭子放入有 1.0mLPBS 的 离心管中备用。 7.1.2 血液或血清样品 采用静脉采血方法， 使用无菌注射 器 抽取 羊只血液 样品置于离心管中待检 或者静置后取上清待检 。 7.1.3 淋巴结样品 取少量样品（ 23 g）于研钵或匀浆器中研磨 ,加 10 mLPBS混匀， 然后将研磨匀浆转入无菌离心管中， 4， 3000 r/min离心 10 min取上清 液转入无菌的 1.5 mL离心管中，编号待检 。 7.1.4 存放 与运输 DB21/T 3253 2020 3 采集或处
10、理的样品在 2 8 条件下保存应不超过 24h；若需长期保存，应放置 -80 冰箱，但应避免 反复冻融（冻融不超过 3次）。采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，在 6 8h之内运送到 实验室检测。按照兽医实验室生物安全技术管理规范进行样品的生物安全标识。 7.2 荧光 RT-PCR 检测 7.2.1 RNA 提取 RNA 的提取可采用手动提取或者使用商品化试剂盒提取，但是注意提取时设立阳性对照、阴性对照。 7.2.1.1 手动提取 RNA 的操作步骤 7.2.1.1.1 将 750 L Trizol 加入 1.5 mL 灭菌离心管中，然后加入 250 L 待检样品， 颠倒混匀后 室温
11、静置 3 5 min。 7.2.1.1.2 7.2.1.1.2 再加入 250 L 氯仿，混匀器上振荡混合 15s（或用手反复颠倒混匀）， 4下 1 3000r/min 离心 15 min。 7.1.1.1.3 小心吸取 450 L 上清液转移至装有 500 L 异丙醇的 1.5 mL 灭菌离心管中，颠倒混匀。 -20室温静置 15 min， 4 1 3000r/min 离心 10 min。 7.1.1.1.4 弃上清液，加入 1 mL 75%的 DEPC 乙醇， 4下 13000 r/min 离心 10 min。重复洗涤 2 次。 7.1.1.1.5 4000 r/min 离心 10s，用微
12、量移液器小心将残余液体吸干，室温干燥 3 10 min。 7.1.1.1.6 干燥后用 20 L DEPC 水溶解管壁上的 RNA，冰上保存备用；若需长期保存应放置 -70冰 箱。 7.2.1.2 试剂盒提取 RNA 严格按照 合法 的 商品化 RNA提取试剂盒 说明书 进行操作。 7.2.2 反应体系的配制 反应体系的成分：去离子水 7.5ul，上游引物 PPRVF 0.5ul，下游引物 PPRVR 0.5ul，探针 PPRVP(10umol/L)0.5ul， 2 qPCR Master Mix 12.5ul， Taq聚合酶 0.5ul，反转录酶 0.5ul，加入 PCR 反应管后震荡离心混
13、匀。 7.2.3 加样 7.2.3.1 打开 PCR 反应管盖，加入 PCR 反应液 20 L,加入样本模板 5 L，阳性对照和阴性对照也各 加 5 L，记录加样顺序。 7.2.3.2 盖 好 PCR 管盖，将 PCR 反应液与样本模板 振 荡混匀后 ， 4， 2000 r/min， 离心 10s。 7.2.3.3 将 PCR 反应管转移到 PCR 区进行上机。 7.2.4 PCR 过程 7.2.4.1 开机预热并检验仪器性能。 7.2.4.2 取样本准备区准备好的 PCR 反应管，放置在仪器样品槽相应位置，并记录放置顺序。 DB21/T 3253 2020 4 7.2.4.3 按表 1 设置
14、仪器扩增相关参数，进行 PCR 扩增 表 1 仪器扩增相 关参数 体系 反应体系设为 25 L 信号 采集 小反刍兽疫病毒 FAM 通道采集荧光信号。 PCR 反应 条件 阶段 条件 循环数 反转录 50： 10min 1 预变性 95： 3min 1 PCR 95： 5s 45 55 ： 60s （此阶段结束时采集荧光信号） 8 试验成立条件与结果判定 8.1 试验成立条件 阳性对照： Ct值 30，有明显指数增长，呈典型的 S型曲线。阴性对照： Ct值 43或无 Ct值，线形 为直线或轻微斜线，无明显指数增长期和平台期。 试验 成立 ，参考图如下： 8.2 结果判定 阳性： 样本检测结果
15、Ct 值 40，有明显指数增长，表明 样本中检测出 该病毒 核酸； 阴性：样本检测结果 Ct 值 43 或无 Ct 值，表明 样本中未检测出 该病毒 核酸； 可疑：样本检测结果 Ct 值在 4043 范围， 判定为可疑； 此时应对样本进行重复检测 ， 如重复实验 结果 Ct 值仍在 4043 范围，有明显指数增长，则判定为阳性，否则为阴性。 结果分析后应保存当前的分析结果，记录好阈值和基线。 9 检测过程中防止交叉污染的措施 DB21/T 3253 2020 5 按照 GB/T 19495.2-2004的规定执行。 10 废弃物处理 按照 农业部关于印发病死及病害动物无害化处理技术规范的 通知（ 农医发 201725号 ）规 定执 行 。 _
