1、ICS 65.120 B 20 备案号： 73359-2020 DB21 辽宁省 地 方 标 准 DB21/T 3278 2020 饲用微生物制剂中凝结芽孢杆菌的检测 Method for determination of Bacillus coagulans infeeds 2020 - 07 - 30 发布 2020 - 08 - 30 实施 辽宁省市场监督管理局 发布 DB21/T 3278 2020 目 次 前 言 . II 1 范围 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3 培养基和材料 . 1 4 主要仪器设备和玻璃器皿 . 1 5 检验程序 . 2 6 采样 . 3 7 试样的制备
2、 . 3 8 试验步骤 . 3 9 结果与报告 . 5 附录 A（规范性附录） 培养基和试剂 . 7 DB21/T 3278 2020 前 言 本标准按照 GB/T 1.1 2009给出的规则编写。 本标准由辽宁省农业农村厅提出并归口管理。 本标准起草单位：大连三仪动物药品有限公司、江苏三仪生物工程有限公司、大连工业大学、开原 市检验检测认证服务中心。 本标准主要起草人：江国托、刘艳、单春乔、李 娟、林洋、王效禹、刘秋晨、马大川、钱方、牟光 庆、刘恩、翟宏旭、曹艳子、顾艳丽、张英雪、杨乔乔、李晶晶、陆继爽、刘星、冷寒冰、曾楠。 本标准发布实施后，任何单位和个人如有问题和意见建议，均可以通过来电
3、和来函等方式进行反馈， 我们将及时答复并认真处理，根据实际情况依法进行评估及复审。 归口管理部门通讯地址：辽宁省农业农村厅（沈阳市和平区太原北街 2号），联系电话： 024-23447862 标准起草单位通讯地址：辽宁省大连市甘井子区营城子镇营旭路 9号，联系电话： 0411-66886298 DB21/T 3278 2020 1 饲用微生物制剂中凝结芽孢杆菌的检测 1 范围 本标准规定了饲用微生物制剂中凝结芽孢杆菌的检测方法。 本标准适用于含有益微生物凝结芽孢杆菌的各种饲料添加剂中凝结芽孢杆菌的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的
4、版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法（ GB/T 6682-2008/ISO 3696： 1987， MOD） GB/T 8170 数值修约规则与极限数值的表示和判定 GB/T 14699.1 饲料采样（ GB/T 14699.1-2005/ISO 6497： 2002， IDT） GB/T 20195 动物饲料 试样的制备（ GB/T 20195-2006/ISO 6498： 1998， IDT） 3 培养基和材料 实验用水参照标准：分析实验室用水规格和试验方法（ GB/T 6682-200
5、8/ISO 3696： 1987， MOD） 3.1 0.85%灭菌生理盐水 3.2 自制改良营养琼脂培养基 (NA)：参见附录 A中的 A.1 3.3 革兰氏染色液：参见附录 A中的 A.2 3.4 细菌生化鉴定试剂盒 3.5 细菌基因组 DNA提取试剂盒 3.6 标准菌株：凝结芽孢杆菌 CICC21736 4 主要仪器设备和玻璃器皿 4.1 恒温培养箱： 50 1 4.2 恒温水浴锅： 80 1 4.3 普通冰箱 4.4 天平：感量为 0.1 g、 0.01 g、 0.0001 g 4.5 振荡器或漩涡混合器 4.6 显微镜： 1000倍 DB21/T 3278 2020 2 4.7 pH
6、计：精确度 0.1 4.8 无菌玻璃或塑料培养皿 =90 mm、无菌锥型瓶、无菌玻璃或塑料涂布棒 4.9 量筒： 250 mL 4.10 PCR仪 4.11 电泳仪 4.12 凝胶成像仪 4.13 移液器：量程 10 L、 100 L、 1000 L、 10000 L 5 检验程序 凝结芽孢杆菌检验程序见下图。 DB21/T 3278 2020 3 6 采样 采集样品真实，具有代表性。采样工具，如铲子、匙、采样器、试管、广口瓶、剪子等，应为无菌 器皿。样品采集后置于 4 8环境内保存，并应及时送到微生物检验室进行检测。采样数量和方式按 GB/T14699.1执行。 7 试样的制备 按照 GB/
7、T 20195进行试样的制备，样品制备后应及时检验。 8 试验步骤 8.1 检样制备、初始悬液和 10 倍稀释 以无菌操作称取试样 25.0 g(mL)，注入盛有 225 mL 0.85%灭菌生理盐水的锥形瓶中。置振荡器上， 设置参数 37、 185 r/min，振荡 60 min，制成 1： 10的初始悬浮液，水浴 80 1维持 10 min。吸取 1： 10的初始悬浮液 1 mL，加入 9 mL 0.85%灭菌生理盐水，经充分混匀后制成 1： 100的稀释液。根据样品含 菌量，按上述操作顺序做 10倍递增 稀释液。 8.2 接种和培养 选择 2个适宜稀释度，每个梯度 2个平行，用无菌移液器
8、分别吸取 0.1 mL稀释液，接种到自制改良营 养琼脂培养基 (NA)上。使用无菌的涂布棒快速、准确地涂布接种于培养基表面，涂布棒不应接触平皿边 缘。每个平皿用一支无菌涂布棒。将涂布好的平皿盖好，置室温中放置 15 min，使菌液浸入培养基，倒 置于 50 1培养箱中培养 24 h 1 h。 8.3 菌落计数 培养后，选取菌落数在 30个 300个之间的平板计数。若平板中有较大片状菌落生长时，则不宜采 用；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀 ，即可计算半个平板后乘以 2以代表 全皿菌落数。典型的凝结芽孢杆菌菌落形状不规则，无隆起，呈灰白色，不透明。然后从中选出 5个特 征菌
9、落进行确证试验。 8.4 确证试验 8.4.1 概述 目前商品化的生化鉴定试剂盒或生化鉴定管，如果采用的培养基与本标准确证试验所用的培养基一 致，可以按照商品说明书使用这些试剂盒或生化鉴定管以进行该项确证试验。目前商品化的细菌基因组 DNA提取试剂盒，如果符合本标准确证试验的要求，可以按照商品说明书使用这些细菌基因组 DNA提取试 剂盒或常用方法以进行该项确证试验。 8.4.2 菌种制备 自凝结芽孢杆菌菌落计数平板上挑取不透明，灰白色单菌落，划线转接培养于自制改良营养琼脂培 养基 (NA)（ A.1）上， 50 1培养 24 h 1 h。从每一平板中选取至少 1个良好分离的特征菌落，转接 保存
10、，进行确证试验。 DB21/T 3278 2020 4 8.4.3 形态观察 将挑选纯化的菌落做革兰氏染色 (A.2)镜检。凝结芽孢杆菌细胞应为蓝紫色，杆状，有芽孢时，芽 孢端生椭圆形，芽孢囊不明显膨大。 8.4.4 生理生化确证试验 将挑选纯化的单一菌落，用生化鉴定试剂盒或者生化鉴定管或者微生物鉴定仪按说明进行鉴定试验。 8.4.5 生理生化确证结果 凝结芽孢杆菌的主要生化特性见表 1。 表 1 凝结芽孢杆菌与其他类似芽孢杆菌的鉴别特征 项目 凝结芽孢杆菌 B.coagulans 枯草芽孢杆菌 B.subtilis 地衣芽孢杆菌 B.licheniformis 侧孢短芽孢杆菌 B.later
11、osporus 短小芽孢杆菌 B.pumilus 厌氧生长 - - 硝酸盐还原 d + - 淀粉水解 - - 明胶液化 - + 利用 丙酸盐 - - - 柠檬酸盐 d - 产酸 D-木糖 d - L-阿拉伯糖 d - D-甘露醇 d + 7氯化钠生长 - 注 ： +：阳性； -：阴性； d：部分菌株为阳性。 8.4.6 PCR 确证试验 8.4.6.1 DNA 提取 用细菌基因组 DNA提取试剂盒或常用提取方法（参见附表 A.3）提取试样 DNA，并设置阴性、阳性 对照。 8.4.6.2 扩增引物序列 上游引物： F 5 -TACGGCATTGGCAAGTATCA-3； 下游引物： R 5 -
12、CGACATGATTTGGTTTTCCA-3。 PCR反应体系如表 2所示。 预计扩增产物大小为 555 bp。 8.4.6.3 PCR 反应 DB21/T 3278 2020 5 反应体系见表 2。 表 2 表 2PCR 反应体系 程序设定如下：预变性： 95 5 min；变性： 95 30 s；退火： 60 30 s；延伸： 72 30 s；终延伸： 72 :10 min; 保温： 4 30 min。步骤至的循环数设为 25。 8.4.6.4 电泳 用电泳缓冲液 (1 TAE)制备 1.0%琼脂糖凝胶，加入 Gelred 染料。取 5 L PCR扩增产物，进行点 样。用 DNA分子量标记物
13、做参照。 3V/cm 5V/cm恒压电泳，电泳 30 min，电泳检测结果用凝胶成像仪 记录并保存。 8.4.6.5 确证结果 当阳性对照孔出现 555 bp扩增带，阴性对照孔未出现目的条带时 ,试验结果成立。 被检样品出现 555 bp扩增带，凝结芽孢杆菌阳性；未出现相应扩增 带的样品判为阴性。 9 结果与报告 9.1 计算每块平板上凝结芽孢杆菌菌落数 计数每块平板上的凝结芽孢杆菌菌落数 a，使用式 (1)计算： baCA (1) 式中： a 计数每块平板上的凝结芽孢杆菌的菌落数； b 挑取后经证实为凝结芽孢杆菌的菌落数； A 挑取平板上用于验证的菌落数； C 平板上所有特征菌落数。 最终结
14、果按照 GB/T 8170数值修约规则修约至整数。 示例： 若某板上长有 78 个典型菌落，从中选出做确证实验的 5 个菌落中有 4 个证实为凝结芽孢杆菌，则： 试剂 使用量（ L ） 2 Es Taq MasterMix 5 上游引物 （ 20 M ） 0.5 下游引物 （ 20 M ） 0.5 模板（ 20 ng/L 100 ng/L ） 1 dd H2O 3 总体积 10 DB21/T 3278 2020 6 按照 GB/T 8170 数值修约规则得 a 为 62。 9.2 样品中凝结芽孢杆菌数的计算方法与报告 选择两个连续稀释度平板 (每个稀释度至少有一块平板，其上经确证后的凝结芽孢杆
15、菌菌数介于 30 个 300个之间 )，通过式（ 2）计算，即为 1 mL或 1 g样品中含有凝结芽孢杆菌的菌数 N： )dnV(nN 21 a0.1 (2) 式中： N 样品中凝结芽孢杆菌菌数； a 所有平板经确证后的凝结芽孢杆菌菌数的总和； V 平板的接种体积，单位为毫升 (mL)； n1 第一个稀释度的平板数； n2 第二个稀释度的平板数； d 第一个稀释度的稀释因子 (未经稀释的液体样品的 d值为 1)。 按照 GB/T8170数值修约规则将计算出的结果保留至两位有效数字，也可将样品的凝结芽孢杆菌菌落 数记录为 1.0 9.9乘以 10的指数幂表示。 报告每 mL或每 g样品的凝结芽孢
16、杆菌估计数，单位 CFU/g（ mL）。 示例 1： 若第一个稀释度（ 10-4）经确证后的菌落数为 170、 166和 238，第二个稀释度（ 10-5）经确证后的菌落数为 50、 75和 80，则： 061606230.000033779103)0.1(30.1 807550238166170 4 N 按照 GB/T8170数值修约规则得出每 mL或每 g样品中含凝结芽孢杆菌估计数为 24 000 000CFU/g（ mL）或 2.4 107 CFU/g （ mL）。 示例 2： 若只有最后一个稀释液（ 10-5）经证实含凝结芽孢杆菌菌落数为 150、 160和 180，则： 51 5 0
17、 1 6 0 1 8 0 4 9 0 1 6 3 3 3 3 3 3 30.0000030 . 1 3 1 0N 按照 GB/T8170数值修约规则得出每 mL或每 g样品中含凝结芽孢杆菌估计数为 160 000 000CFU/g（ mL）或 1.6 108 CFU/g （ mL）。 DB21/T 3278 2020 7 A A 附 录 A （规范性附录） 培养基和试剂 A.1 自制改良营养琼脂培养基 (NA) A.1.1 成分 K2HPO4 1 g 乙酸钠 2.5 g MgSO4 0.1 g MnSO4 0.025 g 半胱氨酸 0.25 g 大豆蛋白胨 5 g 酵母粉 2 g 葡萄糖 5
18、g 溴甲酚紫 0.032 g 琼脂粉 20 g 蒸馏水 1000 mL A.1.2 制法 溶解各成分于水中，必要时加热。调整 pH值，使培养基 pH值在室温时为 5.5， 121灭菌 20 min。 A.2 革兰氏染色 A.2.1 结晶紫染色液 A.2.1.1 成分 结晶紫 1 g 95%乙醇 20 mL 1%草酸铵水溶液 80 mL A.2.1.2 制法 将结晶紫溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。 A.2.2 革兰氏碘液 DB21/T 3278 2020 8 A.2.2.1 成分 碘 1 g 碘化钾 2 g 蒸馏水 300 mL A.2.2.2 制法 将碘与碘化钾先进行混合，加人蒸馏水少许
19、，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至 300 mL。 A.2.3 沙黄复染液 A.2.3.1 成分 沙黄 0.25 g 95%乙醇 10 mL 蒸馏水 90 mL A.2.3.2 制法 将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。 A.2.4 染色法 将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染色 1 min，水洗；滴加革兰氏碘液，媒染 1 min，水洗； 滴加 95%乙醇脱色，约 30 s，水洗；滴加沙黄复染液，复染 1 min，水洗，待干，镜检。 A.3 细菌 DNA提取步骤 A.3.1 细菌培养 细菌接种于 5 mL液体培养基中， 37摇床（ 300 rpm/min）培养过夜。 A.3.2 细菌
20、收集 取 1 mL培养物于 1.5 mL无菌 EP 管中，室温 8000 rpm/min 离心 5 min，弃上清，沉淀重新悬浮于 1 mL TE（ pH8.0）中或用 ddH2O。 A.3.3 菌体裂解 加入 6 L50mg/mL的溶菌酶， 37作用 2h。再加 2 mol/L NaCl 50 L， 10%SDS 110 L， 20 mg/mL 的蛋白酶 K 3 L， 50作用 3 h或 37过夜（此时菌液应为透明粘稠液体）。 A.3.4 抽提 菌液均分到两个 1.5 mL无菌 EP管，加等体积的酚氯仿异戊醇 (25 24 1)，混匀，室温放置 5 10 min， 12000 rpm/min离心 10 min，抽提两次（上清很粘稠，吸取时应小心）。 A.3.5 沉淀 加 0.6倍体积的异丙醇，混匀，室温放置 10 min， 12000 rpm/min离心 10 min。 DB21/T 3278 2020 9 A.3.6 洗涤 沉淀用 75%的乙醇洗涤。 A.3.7 稀释 抽（凉）干后，溶于 50 LddH2O中，取适量作为 PCR 模板。 _
