1、 I DB21 辽宁省地方标 准 DB21/T 3153 2019 桤叶唐棣组培育苗技术规程 Technical regulation on tissue culture and seedling breeding for Amelanchier alnifolia Nutt. 2019 - 05 - 30 发布 2019 - 06 - 30 实施 辽宁省 市场监督管理 局 发 布 ICS 65.020.40 B 60 目 次 前 言 . III 桤叶唐棣组培育苗技术规程 . 1 1 范围 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3 术语和定义 . 1 4 生产设备及化学试剂 . 2 5 生产环境
2、及设备的消毒灭菌 . 3 6 培养基制作 . 4 7 外植体处理方法 . 5 8 组织培养 . 5 9 定植 . 8 附录 A . 9 （资料性附录） . 9 桤叶唐棣形态特征和生物学特性 . 9 附录 B . 10 （资料性附录） . 10 B.1 MS 培养基母液的配制表 . 10 附录 C . 11 （规范性附录） . 11 表 C.1 常用植物生长调节物质配制表 . 11 前 言 本标准依据 GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准的附录 A、附录 B、附录 C 均为 资料性附录。 本标准由辽宁省林业 和草原局 提出并归口。 本标准起草单位：辽宁省 农林旱地 研究所 。 本标
3、准主要起草人： 黄立华 、 王占龙 、 朱虹 、 龙忠伟 、 郑璐 、 尚福强 、 赵兴秋 、 蔡静 、 鹿天阁 、 孟春 雷 、 于欣 、 王艳辉 、 王鹏 、 王玉峰 、 金亚荣 、 王春丽 、 王孝军 、 董立军 、 刘杰 、 李在芬 、 王玉峰 、 步 兆东 。 DB21/T 3153 2019 1 桤叶唐棣组培育苗技术规程 1 范围 本标准规定了桤叶唐棣（ Amelanchier alnifolia Nutt.)组培育苗技术的术语和定义、生产设备及化 学试剂、生产环境及设备的消毒灭菌、培养基制作、外植体处理方法、组织培养程序、定植等技术要求。 本标准适用于辽宁省桤叶唐棣组培快繁育苗。
4、 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文 件，仅所注日期的版本适用于本文件 。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 1882 林木组织培养 育苗 技术规程 GB 4285 农药安全使用标准 GB/T 8321 农药合理使用准则 3 术语 和 定义 下列术语和定义适用于本 文件 。 3.1 桤叶唐棣 Saskatoon berry 蔷薇科（ Rosaceae）唐棣属落叶灌木或小乔木。原产于北美洲从美国阿拉斯加州至横穿加拿大西部的 大部分地区以及美国中西部和中北部地区，其生长地势从北部的海平面一直到加利福尼亚州海拔 26
5、00m甚 至落基山脉海拔 3400m的高度。桤叶唐棣较喜光，尤其是果实成熟期需要大量的阳光，同时具有抗寒、耐旱、 对气候和土壤适应性强的特点，能适应大多数土壤类型如栗钙土、黑钙土、褐色土和棕壤等。原生地气候 条件为亚寒带和温带大陆性干旱、半干旱气候，年均气温 -3.2 9.4 ，无霜期 80 120d，能适应冬季 -40严寒。 3.2 无菌培养体系的建立（初代培养） Establishment of aseptic culture system 将灭过菌的外植体接种于培养基上，诱导出愈伤组织或芽的培养过程。 3.3 生根培养 Take root culture DB21/T 3153 2019
6、 2 将继代培养产生的无根芽苗接种到生根培养基中，经诱导生根得到完整的试管植株的过程。 3.4 试管苗 seedling in vitro 培养在培养瓶中无污染的 ， 具有根、茎、叶的完整植株。 3.5 炼苗 Acclimatization 将试管苗移至日光温室或大棚进行强光锻炼。 3.6 移栽 transplanting 在设施育苗情况下，将试管苗从培养瓶内移到瓶外，采取降温、控水等措施进行逐步锻炼的过程，使 其定植后能适应露地的不良环境条件。 3.7 褐化 brown 外植体在离体培养过程中，培养物从伤口处分泌褐色物质进而导致自身长势不佳甚至死亡的现象。 3.8 玻璃化 vitrifica
7、tion 在组织培养过程中，试管苗生长异常，叶、嫩梢呈水晶透明或半透明、水浸状；整株矮小肿胀、失绿； 叶片皱缩成纵向卷曲，脆弱易碎。 3.9 增殖系数 proliferation coefficient 外植体再生形成的芽的平均数。 3.10 定植 planting 将移栽成活后的试管苗移到圃地的过程。 4 生产设备及化学试剂 4.1 组培场地 选择 组培实验室必须选择安静、清洁、无污染的地方。 4.2 接种设备 超净工作台、解剖刀、镊子、酒精灯、医用小推车、广口瓶、白瓷碟、无菌滤纸。 DB21/T 3153 2019 3 4.3 灭菌设备 高压蒸汽灭菌锅、紫外线灯、烘干箱 4.4 灭菌药剂及
8、辅助剂 75%酒精 、 90% 酒精 、 0.1%升汞 、高锰酸钾、甲醛、 84 消毒液、洗衣粉、 洗涤灵 等。 4.5 培养基及植物生长调节剂 MS 培养基、 6-苄氨基嘌呤 、 奈乙酸 、 吲哚丁酸 、白糖、琼脂等。 4.6 培养设备 300ml 培养瓶、培养架、空调、照明灯管。 4.7 试验设备 冰箱、电子天平、（ 0.01mg、 0.001mg）、磁力搅拌器、酸度计、照度计、温湿度表、移液枪、移液管、 试剂瓶、容量瓶、烧杯等。 5 生产环境及设备的消毒灭菌 5.1 培养瓶清洗与消毒 将 使用过的培养瓶或盛培养基的玻璃器皿中 污物如培养基、培养物倒掉，再浸入水中，然后洗涤。有 微生物污染
9、的器皿，必须先进行高压消毒和煮沸，杀死菌体 后进入 水中洗涤 。器皿洗净后，烘干或晾干， 放在规定的地方， 以待 取用。 5.2 接种器械灭菌 5.2.1 高压蒸汽灭菌 使用前接种器械、器皿及定性滤纸用牛皮纸包裹后再用聚丙烯薄膜裹紧、包扎。 将分装好的培养基和 接种用具放入高压锅的消毒桶内，锅内灭菌物不超过锅容量的 3/4为宜 ， 高压灭菌时锅内使用蒸馏水 。 打开 电源加热，压力保持在 0.105 MPa 0.12MPa（注意压力不要 超过 0.14MPa），时间为 30min。 5.2.2 灼烧灭菌 在无菌操作时，把镊子、剪子、解剖刀等浸入 250ml 500ml的 装有 75%酒精 的
10、广口瓶中，使用之前取 出在酒精灯 外焰处 灼烧 灭 菌 ， 冷却后，立即使用。每次重新操作都要把工具在火焰上消毒。 5.3 紫外线灭菌 转接操作前，在接种室、超净工作台用紫外线灯 照射 25min 30min。 5.4 准备室消毒 每天用 84消毒液稀释至 1000倍或 75%酒精 喷洒洗涤准备室地面，保持室内清洁。 5.5 接种室及培养室消毒灭菌 DB21/T 3153 2019 4 房间关闭紧密，将甲醛置于广口容器中，加高锰酸钾氧化挥发 ，熏蒸 2d 3d,通风无味后 2d 3d人员方 可进入 。 接种室每 30d用高锰酸及甲醛混合熏蒸，培养室每 60d用高锰酸及甲醛混合熏蒸。工作期间每
11、3d用 75%酒精 喷雾消毒。 5.6 无菌操作 (a)进入 无菌室前， 洗手，去掉指甲中的污物。 (b)入室时 换 上经过消毒的工作服、帽子、口罩和鞋子等。 工作人员 操作前 用 75%的 酒精 擦洗 双 手，操 作中 需 经常用 酒精 擦洗手。 (c) 操作前用 75%酒精 擦拭操作台台面及内壁。 (d)操作时，右手拿培养瓶，左手轻轻拉开瓶口绑绳放在台面上，左手中指和无名指夹住封口膜后掀开， 将培养瓶口倾斜靠近酒精灯火焰上旋转灼烧瓶口数秒，用灼烧消毒冷却后的镊子将转接材料接种到培养基 中，每个培养容器中接种小芽丛或单芽的数量为 3 株 4 株，且分布均匀，接种后盖上封口膜包扎，并标注 日期
12、。 (e)接种时，在无菌滤纸上切取材料，刀和镊子等接种工具，使用一次即放入 75%酒精 中浸泡，然后灼 烧放凉备用。 (f)接种时，超净工作台上的风机要始终保持开启状态，确保通风顺畅。 (g) 操作过程中 不准讲话，亦不准对着操作区呼吸 。 (h)每次接种完毕后，用 75%酒精 将工作台台面及内壁擦拭干净，并将接种器皿及接种工具重新进行消 毒处理。 6 培养基制作 6.1 培养基母液的配制与保存 6.1.1 培养基母液的配制 选用试剂纯度为 分析纯的化学药品，根据 MS 培养基配方，分别配制大量元素（ 10 倍）、微量元素（ 100 倍）、铁盐（ 100 倍）、有机物（ 100 倍） ，母液配
13、制使用蒸馏水或去离子水。 MS 培养基母液配制比例参见 附 录 B。 6.1.2 培养基母液的保存 培养基母液分别贴上标签，标注名称、配制倍数和日期，置于 0 4保存。铁盐应储存在棕色容器 中。 6.2 植物生长调节物质母液的配制 6.2.1 配制方法和浓度 先用 0.1molL-1 的 盐酸 或 95%酒精 溶解，然后加少量蒸馏水定容。 具体配制方法和浓度参见附 录 C。 6.2.2 保存 母液配制好后 储存在棕色容器中 贴好标签并置于冰箱内保存，温度控制在 0 4。 DB21/T 3153 2019 5 6.3 培养基配制、灭菌及保存 6.3.1 培养基配制 根据培养基配方需求，称量琼脂（
14、 8g L-1）、白糖（ 30 35g L-1） ,用 70% 80%最终体积的水加热溶解， 然后按计算量依次加入 MS 母液、植物生长调节物质，定容后用 0.1mol L -1NaOH 溶液 或 0.1molL -1盐酸 溶液调节 pH 值（ 5.5 5.8），定量分装至培养瓶中并封口、标记。 6.3.2 培养基灭菌 瓶装培养基应在 12h内完成灭菌程序，灭菌方式采用高压蒸汽灭菌，在压力 0.105MPa、温度 121条件 下灭菌 15min 20min。 操作方法同 5.2.1。 6.3.3 培养基保存 灭菌后的培养基放入接种室，避光、防尘保存。常温条件下 7d 内使用， 2 4条件下 1
15、4d 内使用完。 7 外植体处理方法 7.1外植体采集 生长旺季（ 6月初 7月末），在晴天或露水干后剪取母株当年生长健壮的枝条 作为外植体。 外植体宜 当天采集，当天处理，运输过程要保证低温、保湿，迅速带回组培室。 7.2 外植体茎段修剪 剪下植株后去除叶片，留取有 健康饱满腋芽的茎段 。茎段长度 4cm 5cm,一般有 1 2个 腋芽 。 7.4 外植体清洗 修剪好的茎段按木质化程度放置于不同的烧杯中， 加入 洗涤灵 进行表面冲洗，洗好后冲洗掉泡沫，放 在水龙头下冲洗。冲洗 1h 2h 后，置于超净工作台（已开机、灭菌 20min 以上）备用。 7.5 0.1%升汞配制 称取 1g升汞，加
16、蒸馏水溶解，定 容 至 1L，装入棕色瓶中，用封口膜扎紧瓶盖，贴上标签，标明配制浓 度、日期。 使用的升汞消毒液应按照国家有关剧毒化学药品使用的法规进行处理，可参见医疗用毒性药品管理 办法（中华人民共和国国务院第 23号令）。见附录 D。 7.6 无菌水配制 将纯净水装入玻璃瓶中，扎紧封口膜，放入高压锅内灭菌，保持锅内气压在 0.105 MPa 0.12MPa（ 121 123）， 30min。 7.7 外植体表面灭菌 用 75%酒精 浸泡 30s，无菌水冲洗 2 次 3 次 ，然后按材料的木质化程度，分别用 0.1%升汞 浸泡 6min 8min，最后用无菌水冲洗 5 次 6 次。 8 组织
17、培养 8.1 无菌培养体系的建立 DB21/T 3153 2019 6 8.1.1 诱导培养基 MS+BA0.6mgL -1+NAA0.12mgL -1+IBA1.4mgL -1 +糖 35gL -1+琼脂 8gL -1 8.1.1 外植体接种 用手术刀从外植体上切下完整的腋芽， 按照正常生长方向接入腋芽诱导培养基中诱导营养芽。 8.1.2 培养条件 培养室温度设定为 25 2。 光照 强 度为 2500 lx 3000lx， 每天照射 14 h 16h。 8.1.3 培养周期 40d 50d。 8.1.4 褐化苗处理 发现组培苗出现褐化现象后，立即采取以下措施，直至褐化现象完全消失。 (1)
18、关闭照明电源，进行暗培养。 (2)降低培养室温度 至 15 20。 (3)将褐变苗转入新培养基，然后每天继续 转接 一次 至新培养基 ，连续 转接 7d。 8.2 继代增殖 8.2.1 培养基配方 MS+BA2.5mgL-1+IBA1.0mgL-1+糖 35gL-1+琼脂 8gL-1。 8.2.1 丛生芽 接种 当初代诱导的不定芽长到 1.5cm或以上时，将萌发的幼芽从基部切下，去掉茎尖，并接种到继代培养基 中进行不定芽的增殖培养。 8.2.3 培养条件 培养条件同 8.1.2。 8.2.4 培养周期 30d 45d。 8.2.5 继代苗质量标准 无污染、无玻璃化、叶鲜绿、生长健壮。 8.2.
19、6 玻璃化苗处理 (1)低温 培养 （ 20 2 ） 。 (2)增加琼脂浓度 （ 约 增加 2 gL-1，具体视培养基硬度确定） 。 (3)增加光照 强度至 3000lx 3500lx。 8.3 生根培养 8.3.1 生根培养基 DB21/T 3153 2019 7 1/2MS+NAA1.5mgL-1+IBA1.5mgL-1+糖 30gL-1+琼脂 8gL-1。 8.3.1 生根苗接种 将 1.5cm以上、生长健壮的不定芽切成单芽接种在生根培养基中。 8.3.2 接种株数 每瓶接种 10 15株 ，具体株数视培养瓶直径确定，以不影响组培苗生长为限 。 8.3.3 培养条件 培养条件同 8.1.
20、2。 8.3.4 生根率 生根率 90%。 8.3.5 培养周期 45d 60d。 8.3.6 生根苗质量标准 叶片绿色，株高 3.0cm，根茎粗 0.1cm，节间 2 3个，单株复叶 4片，根白柔软，根数 6条，平 均根长 1.5cm 2.0cm。 8.4 炼苗 8.4.1 炼苗季节 4月 6月或 8月 9月。 8.4.2 强光闭瓶锻炼 将瓶装试管苗移至日光温室或大棚，温度控制在 35以下， 保留瓶盖 培养 10d左右。 8.4.3 强光开瓶锻炼 闭瓶锻炼结束后，除去瓶盖继续锻炼 2d 5d，培养基表面未出现大量杂菌前进行移栽。 8.5 移 栽基质 8.5.1 移栽基质配方 移栽基质配方为：
21、草炭土 细河沙 壤土 3 5 2。 8.5.2 移栽基质处理 基质过筛后混匀，混匀过程中喷洒 0.2%代森锰锌水溶液消毒，混匀后堆沤覆膜 、 压严， 3后装杯。 8.6 移栽容器 规格为 8cm 6cm 7cm的营养钵。 8.7 移栽种植 DB21/T 3153 2019 8 移栽前，用自来水把根系上的 培养基冲洗干净， 用 0.1%的多菌灵溶液浸泡组培苗根部 3s 5s后栽入已准 备好的营养钵中。 8.8 移栽管理 8. 8.1 温度管理 通过遮阳网、喷水、湿帘等因地制宜措施，将环境 温度控制在 30 2。 8.8.2 湿度管理 栽完一个苗床，浇定根水后 搭建高 50cm、 宽 1.2 、
22、长 6.0m 的塑料小拱棚。 移栽后前 3d 每天早晚各 喷一次水，保持 80% 90%的空气湿度。 3d 后逐渐揭膜通风直至完全去除塑料薄膜。 8.8.3 光照管理 移栽后的前 20d 用遮光率为 75%的遮阳网进行遮荫， 20d 后逐渐卷起遮阳网增加透光率，直至完全去 掉遮阳网。 8.8.4 根腐病 防治 栽后马上喷施 1： 1： 100 的波尔多液预防，以后每 7d 再喷施 1 次。发病初期用采用 0.1%的甲基托布 津或 0.1%的多菌灵溶液交替喷洒根茎部，连续防治 2 次 3 次，间隔 7d。 8.8.5 根部 虫 害 防治 喷施 0.1%毒杀蜱，连续防治 2 次 3 次，间隔 7d
23、。农药使用应符合 GB 4285 和 GB/T 8321(所有部分 的 规定 ) 8.8.6 施肥管理 移栽 20d 后，叶面喷施 0.3%的磷酸二氢钾。移栽 30d 后，配合浇水，水中适量加入磷酸二铵。也可每 20d 喷施 MS 母液 80 100 倍液。肥料使用 具体按 NY/T 489 执行 。 9 定植 9.1 定植季节 翌年春末至夏初（ 5月 6月）。 9.2 定植苗标准 苗高 10 cm，根茎粗 0.5cm， 根系 发达 。 9.3 定植方法 将组培苗带基质移栽至苗圃，喷施 0.05% 0.10%抗蒸腾剂 Cacl2或 NaHSO3。 DB21/T 3153 2019 9 附录 A
24、 （ 资料性附录 ） 桤叶唐棣 形态特征和生物学特性 A.1 分布 桤叶唐棣是北美洲的乡土树种，分布范围十分广泛，北到加拿大的育空地区，南到美国的新墨西哥州， 东到五大湖，西到美国阿拉斯加，几乎占北美洲 2/3 区域，约横穿了 30 个纬度。目前欧洲的英国、俄罗斯 等国有栽培，我国为首次引进。 A.2 形态特征 落叶丛生的灌木或小乔木，树高 1m 4m， 树皮褐黑色，小枝呈褐色或灰白色， 叶互生，椭圆状倒卵 形或椭圆状，先端急尖或短渐尖，基部宽楔形，边缘有细锯齿，无毛，网脉不明显；叶柄短，长约 0.2cm 0.3 cm；托叶条形，边缘有腺齿。 总状伞房花序或复伞房花序，直径 3cm 5cm，花
25、瓣线状圆形、花萼筒状， 初外被白色绒毛，后逐渐脱落。浆果状梨果，果实球形，直径约 5mm 15mm，成熟时紫黑色，果肉外部红 褐色，内部乳白色，汁液红褐色。 A.3 适应性 桤叶唐棣较喜光，果实成熟期需要大量的阳光，抗寒、耐旱、对气候和土壤适应性强，能适应大多数 土壤类型如栗钙土、黑钙土、褐色土和棕壤等。原生地气候条件为亚寒带和温带大陆性干旱、半干旱气候， 年均气温 -3.2 9.4，无霜期 80 120d，能适应冬季 -40严寒。 适合我国长江以北至黑龙江地区 生长。 A.4 物候 桤叶唐棣在辽西一般在 3月 末 花芽开始膨大， 4月下旬开花。 生长期为 200d 210d，开花结果物候期为
26、 60d 70d，果实生长物候期为 40d 50d。 A.5 经济特征 桤叶唐棣组织培养苗一般 3年即开始结实， 5-7年进入盛果期。结果盛期每公顷产量为 3300kg 4500kg。 盛果期一般为 20a。果实无论是外观、味道还是成分组成均与蓝莓存在一定的相似之处，含有大量的人体所 需的总膳食纤维及微量元素，目前加拿大已生产出以果酱、果汁、果酒为主的系列产品几十种和多种药品。 最近研究表明，桤叶唐棣浆果含有抗氧化剂，可预防心脏病 、 癌症 等 恶化。 DB21/T 3153 2019 10 附录 B （资料性附录） B.1 MS 培养基母液的配制表 成 分 名 称 分子式或英文名 用 量（
27、mg/l) 每升培养基取用量（ ml) 贮备液 硝酸铵 NH4NO3 33000 大 销酸钾 KNO3 38000 量 二水氯化钙 CaCl2 2H2O 8800 50 元 硫酸镁 MgSO4 7H2O 7400 素 磷酸二氢钾 KH2PO4 3400 贮备液 微 碘化钾 KI 166 硼酸 H3BO3 1240 量 硫酸锰 MnSO4 4H2O 4460 硫酸锌 ZnSO4 7H2O 1720 5 元 钼酸钠 Na2MoO4 2H2O 50 硫酸铜 CuSO4 5H2O 5 素 氯化钴 CoCl2 6H2O 5 贮备液 铁 硫酸亚铁 FeSO4 7H2O 5560 5 盐 乙二胺四乙酸二钠
28、Na2 EDTA 2H2O 7460 贮备液 有 肌 醇 Myo-inositol 20000 机 烟 酸 Nicotinic acid(vit B5) 100 5 成 盐酸吡哆醇 Pyridoxine. HCl 100 分 盐酸硫胺素 Thiamine.HCl 20 甘氨酸 Glycine 400 DB21/T 3153 2019 11 附录 C （规范性附录） 表 C.1 常用植物生长调节物质配制表 化学试剂名称 分子式或英文名 级别 配制方法 配制浓度 mgL -1 6-苄氨基嘌呤（ 6 BA） 6-Benzylaminopurine BR 先用 0.1molL -1的盐酸（ HCl） 溶解，然后加少量蒸馏水定容。 1000 萘乙酸（ NAA） 1-Nnphthylacetic acid BR 先用 95%酒精 溶解，然后加少量蒸馏水定容。 50 吲哚丁酸（ IBA） Indole-3-butyric acid BR 先用 95%酒精 溶解，然后加少量蒸馏水定容。 500 A _
