1、ICS 11.220 B 41 DB21 辽宁省 地 方 标 准 DB21/T 3256 2020 非洲猪瘟病毒等温扩增快速检测方法 Loop-mediated Isothermal Amplification（ LAMP） for Rapid Detection for African Swine Fever Virus 2020 - 04 - 30 发布 2020 - 05 - 30 实施 辽宁省市场监督管理局 发布 DB21/ XXXXX XXXX I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1 2009 给出的规则起草。 本标准由辽宁省农业农村厅提出并归口管理。 本标准起草单位：辽宁省农业发
2、展服务中心、中国科学院微生物研究所、洛阳莱普生信息科技有限 公司、辽宁佰瑞生物科技有限公司。 本标准主要起草人：杨作丰 、周晨阳、李秀梅、王宏燕、杨利敏、董娜、刘文军、张皓淳、姚伟、 刘洋、刘近、吴洪涛、任雪建、赵培、李蓉、章春燕、吕园园、 陈腾 。 本标准发布实施后，任何单位和个人如有问题和意见建议，均可以通过来电和来函等方式进行反馈， 我们将及时答复并认真处理，根据实际情况依法进行评估 及复审。 归口管理部门通讯地址：辽宁省农业农村厅（沈阳市和平区太原北街 2号），联系电话： 024-23447862； 标准起草单位通讯地址：辽宁省动物及产品检疫中心（沈阳市沈河区万柳塘路 105号甲），联
3、系电 话： 024-24229579。 DB21/T 3256 2020 1 非洲猪瘟病毒等温扩增快速检测方法 1 范围 本标准规定了非洲猪瘟病毒等温扩增快速检测方法的技术要求。 本标准适用于非洲猪瘟疫病的诊断、监测及流行病学调 查，适用于猪血液、脾脏、淋巴结、肾脏等 组织样品中非洲猪瘟病毒核酸的快速检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 3 原理 非洲猪瘟病毒是一种 DNA病毒，该检测方法利用 6条
4、特异性引物和具有链置换能力的 DNA聚合酶，在 等温环境下 1 h内完成扩增，用于非洲猪瘟病毒的核酸检测。 4 仪器和器材 4.1 高速台式冷冻离心机（离心范围 0 20000 r/min） 4.2 冰箱： 4 1 冰箱， -20 1 冰箱， -7 1 冰箱 4.3 恒温 LAMP 扩增仪（型 号： Gene-8C） 4.4 离心管： 15 ml 离心管、 1.5 ml 离心管和 0.2 ml PCR 专用离心管 4.5 微量移液器： 1000 l， 200 l， 100 l， 50 l， 20 l， 10 l， 2 l 5 试剂和引物 5.1 样品处理剂 5.2 ASFV-R-Mix 5.3
5、 Bst enzyme 5.4 D-I 矿物油 5.5 阳性对照 5.6 阴性对照 注：本技术规范中使用的试剂，除另有说明外，所有实验使用的试剂等级均为不含 DNA或 DNase的分析纯或生化试剂； 所有试剂均用无菌的容器分装。 DB21/T 3256 2020 2 6 操作 步骤 6.1 样品的采集、前处理、存放与运输 6.1.1 采样注意事项 采集样品及样品前处理过程中应戴一次性手套，样本间不得交叉污染。 6.1.2 采样工具 15 ml离心管和 1.5 ml离心管经 121 1 高压灭菌 20 min；剪刀、镊子经 160 干热灭菌 2 h，无 菌管（真空采血管）。 6.1.3 组织病料
6、的采集与前处理 采集疑似非洲猪瘟病毒感染猪的肺脏、肝脏、肾脏、脾脏等组织样品，用无菌的剪刀和镊子剪取待 检样品约 10 g于组织匀浆器或研钵中充分匀浆或研磨，加入 0.3 ml 0.5 ml组织悬液混匀， 60 ， 30 min 灭活后，将悬液转入无菌 Eppendorf管中， 4 条件下 5000 r/min离心 10 min，编号备用。 6.1.4 全血及血清样本的采集与前处理 使用含有抗凝血剂（ EDTA-紫色盖）的无菌管（真空采血管）从耳静脉或前腔静脉采集血液 3 ml 5 ml， 60 ， 30 min灭活后，可直接检测； 若检测血清，可静置全血样本待血清析出后，直接吸取至无 菌 E
7、ppendorf管中， 60 ， 30 min灭活后，编号备用。 6.1.5 存放与运输 采集或处理的样品在 2 8 条件下保存应不超过 24 h； 若需长期保存，应放置 -70 冰箱，但应 避免反复冻融（冻融不超过 3次）。采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，在 8 h之内运送 到实验室检测。按照兽医实验室生物安全技术管理规范进行样品的生物安全标识。 6.2 样品 DNA 的提取 取 10 l前处理过的样本加入无菌 1.5 ml离心管，加入 10 l样品处理剂，混匀， 94 裂解 2 min， 瞬时离心，上清即为扩增模板。 6.3 核酸扩增 6.3.1 吸取 22 l ASFV-R
8、-Mix 和 1 l Bst enzyme 加入同一个 PCR 管，吸取 2 l 步骤 6.2 处理的 核酸扩增模板加至 PCR 管，混匀，设置阴阳性对照； 6.3.2 吸取 10 l D-I 矿物油轻轻加至 PCR 管液面，切勿震荡混匀； 6.3.3 插入到恒温扩增仪反应槽中； 6.3.4 设置恒温扩增仪器反应条件为： 65 反应 12 min，荧光采集周期 20 s。 7 试验成立条件与结果判定 7.1 试验成立条件 使用前用阴、阳性对照进行该检测方法评价，若阳性对照 CT值 40，阴性对照 CT值 40，则检测结 果有效。 DB21/T 3256 2020 3 7.2 结果判定 若 CT
9、值 40，样品应判定为非洲猪瘟病毒核酸阳性；若 CT值 40，样品应判定为非洲猪瘟病毒核酸 阴性 8 实验室生物安全要求 按照 GB19489 实验室生物安全 通用要求执行。 DB21/T 3256 2020 4 A A 附 录 A （规范性附录） 试剂配制 A.1 样品处理剂的制备 量取 80 ml PBS（ 0.01 mol/L， pH值 7.4），加入 10 l NP40（乙基苯基聚乙二醇），无菌纯化水 定容至 100 ml，定量分装， 500 l/管， -20 保存。 A.2 ASFV-R-Mix的制备 A.2.1 引物合成 根据非洲猪瘟病毒 p72基因片段的保守结构域设计 3对引物，
10、包括 1对内引物（ FIP与 BIP）、 1对外引 物（ F3与 B3）和 1对环引物（ LF与 LB），均由上海生工生物工程股份有限 公司合成，序列为： FIP： 5-TAACGCCACTATGCAGCCCACGGAAGAGCTGAATCTCTATCCT-3 BIP： 5-CAACATGTGCGAACTTGTGCCACATACCTGGAACGTCTCC-3 F3： 5-ATAGGTAATGCGATCGGATACA-3 B3： 5-CCAACAATAACCGCCACGC-3 LF： 5-TCGCCACGCAAAGATAAGC-3 LB： 5-AGCCTCGGTGTTGATGCGGATT-3 A
11、.2.2 引物混合物的 制备 取 3对引物（ FIP、 BIP、 F3、 B3、 LF和 LB）干粉，按引物说明书分别加入适量无菌纯化水，溶解混 匀，得到各引物溶液，置 -20 保存。 A.2.3 ASFV-R-Mix的配制 称取 2.4 g Tris， 0.37 g氯化钾， 0.12 g硫酸镁， 100 l吐温 -20， 7.029 g甜菜碱，溶于 80 ml 纯化水，依次加入终浓度为 1.4 mmol/L dNTPs溶液、 0.2 mol/L外引物溶液、 1.6 mol/L内引物溶液、 0.8 mol/L环引物溶液，加入无菌纯化水定容至 100 ml，经过 0.22 m滤器过滤除菌，分装至
12、 2 ml蓝 盖可立冻存管中， 1.1 ml/管， -20 保存。 A.3 Bst enzyme的制备 用于制备本试剂盒的 Bst enzyme为商品化 DNA聚合酶，按使用说明书用纯化水稀释至 4 106/L，分 装至 0. 5ml白盖可立冻存管中， 100/ l管， -20 保存。 A.4 D-I矿物油 用于制备本试剂盒的 D-I矿物油为商品化矿物油，分装至 2 ml黄盖可立冻存管中， 500 l/管， -20 保存。 A.5 阳性对照 采用核酸蛋白质分析仪测定阳性 质控品浓度，计算质粒拷贝数，用纯化水将其稀释为 103拷贝 / l， 分装至 0.5 ml红盖可立冻存管中， 100 l/管， -20 保存。 A.6 阴性对照 取纯化水，分装至 0.5 ml绿盖可立冻存管中， 100 l/管， -20 保存。 DB21/T 3256 2020 5 _
