1、ICS 11.220 B 41 DB21 辽宁省 地方标准 DB21/T 3273 2020 猪伪狂犬病毒野毒株与 gE 基因缺失疫苗株 TaqMan 实时荧光定量 PCR 鉴别方法 A TaqMan Real-time PCR Method for Differentiation of Wild-type Strain from gE-deleted Vaccine Strain of Pseudorabies Virus 2020 - 06 - 30 发布 2020 - 07 - 30 实施 辽宁省市场监督管理局 发布 DB21/T 3273 2020 I 目 次 前言 . II 1 范围
2、 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3 缩略语 . 1 4 仪器和耗材 . 1 5 试剂和材料 . 1 6 样品采集、处理和运输 . 2 7 荧光 qPCR 操作程序 . 3 8 结 果判定 . 4 附录 A（规范性附录） 溶液配制 . 6 附录 B（规范性附录） 引物和探针 . 7 DB21/T 3273 2020 II 前 言 本标准根据 GB/T 1.1-2009的有关规定进行制定。 本标准由辽宁省农业农村厅提出并归口管理。 本标准负责起草 单位：辽宁省农业发展服务中心。 本标准起草人：兰德松、顾贵波、周维、杨洺扬、李 可心、 孙世宇、张健、刘 贺、李旭 、高原、丁 静。 本标准发布实
3、施后，任何单位和个人如有问题和意见建议，均可以通过来电和来函等方式进行反馈， 我们将及时答复并认真处理，根据实际情况依法进行评估及复审。 归口管理部门通讯地址：辽宁省农业农村厅（沈阳市和平区太原北街 2号），联系电话： 024-23447862 标准起草单位通讯地址：辽宁省农业发展服务中心（沈阳市皇姑区宁山东路 29号），联系电话： 024-88420057 DB21/T 3273 2020 1 猪伪狂犬病毒野毒株与 gE 基因缺失疫苗株 TaqMan 实时荧光定量 PCR 鉴别方法 1 范围 本标准规定了猪伪狂犬病毒（ pseudorabies virus,PRV） 野毒株及 gE基因缺失毒
4、株的 TaqMan荧光 PCR 检测方法。 本标准适用于猪血液、组织脏器、精液、鼻腔拭子和细胞培养物等材料中 PRV核酸的检测以及 PRV 野毒株与 gE基因缺失疫苗株病毒核酸的鉴别检测。 本标准的实验操作应在生物安全 II级实验室（ BSL-2实验室）中进行。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件 。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 缩略语 下列缩略语适用于本标准。 gD 糖
5、蛋白 D（ glycoprotein D） gE 糖蛋白 E（ glycoprotein E） PRV 伪狂犬病病毒（ pseudorabies virus） 4 仪器和耗材 4.1 仪器 荧光 PCR仪、高速冷冻离心机（可控温至 4 ，离心速度可达 12 000r/min以上 ）、组织研磨仪 或研钵、自动化核 酸提取仪（如选用商品化核酸提取试剂盒）、 PCR微量离心机、 2 8 普通冰箱、 -20 以下普通冰箱、 -70 以下超低温冰箱、移液器（量程 0.1 L 2 L、 2 L 20 L、 20 L 200 L）。 4.2 耗材 无菌无 DNA酶的 1.5 mL离心管、 0.2 mL PC
6、R反应管或八联管或 96孔反应板、与移液器匹配的吸头。 5 试剂和材料 DB21/T 3273 2020 2 5.1 DNAzol Reagent：商品化 DNA 提取试剂， 2 8 普通冰箱中保存；或商品化核酸提取试剂 盒（如磁珠法核酸提取试剂），通常 18 25 保存。 5.2 无水 乙醇： -20 普通冰箱中 预冷。 5.3 75%乙醇：用无水乙醇和双蒸水配制， -20 普通冰箱中 预冷。 5.4 PBS：磷酸盐缓冲液（ 0.02 mol/L pH7.2），配制见附录 A。 5.5 8 mmol/L NaOH 溶液， 配制见附录 A。 5.6 2 TaqMan Fast qPCR Mas
7、ter Mix：为商品化探针法实时荧光 PCR 反应专用试剂，包含反应所需的缓 冲液、酶、 dNTP、 Mg+等的预混液， -20 普通冰箱中保存，避免反复冻融。 5.7 引物和 TaqMan 探针，序列见附录 B。 5.8 阳性对照和阴性对照：阳性对照使用 PRV 野毒株细胞培养物 、 Bartha-K61 疫苗毒，阴性对照采用 灭 菌双蒸水或健康猪的组织材料。 5.9 除非另有说明，在检测中所用的试剂均为分析纯，实验室用水应符合 GB/T 6682 的要求。 6 样品采集、处理和运输 6.1 采样前准备 6.1.1 采样人员 参照 NY/T 541中第 5.1条的要求。 6.1.2 采样工
8、具和器材 参照 NY/T 541中第 6.10.3条的要求。 6.2 样品采集 6.2.1 血液：参照 NY/T 541 中第 6.1 条中猪血液样品采集的要求进行，将采集的血液注入含 1/10 体积 4 %EDTA 溶液的无菌容器中，充分混匀，编号备检。 6.2.2 组织脏器：参照 NY/T 541 中第 6.2 条和 6.3 条中的要求进行，将采集的病死猪或剖杀猪主要脏器（脑 组织、三叉神经节、扁桃体、肺脏、淋巴结等）或活体采集的扁桃体装入灭菌的 15 mL 50 mL 离心管中， 编号备检；组织脏器使用组织研磨仪或研钵进行处理后用于核酸提取。 6.2.3 精液：参照 NY/T 541 中
9、第 6.10.3 条中的要求进行。 6.2.4 鼻腔拭子：参照 NY/T 541中第 6.4条中的猪鼻腔拭子采集要求进行，将拭子样品放入 PBS缓冲液（ 0.02 mol/L pH7.2）中，编号备检。 6.2.5 细胞培养物：细胞培养物反复冻融 3 次，第 3 次解冻后， 4 4 000 g 离心 10 min，取上清转入新 的无菌无 DNA 酶的 1.5 mL 离心管中，编号备用。 6.3 样品保存、包装和废弃物处理 参照 NY/T 541中第 7条的要求。 DB21/T 3273 2020 3 6.4 样品运输 参照 NY/T 541中第 9条的要求。 7 荧光 qPCR 操作程序 7.
10、1 DNA 提取 在实验室的核酸提取区进行。 7.1.1 DNAzol 手工提取 7.1.1.1 取 n 个无菌无 DNA 酶的 1.5 mL 离心管， n 为待检样品数 +阳性对照 +阴性对照，对每个离心管进行 编号。 7.1.1.2 每管加入 800 L DNAzol，分别加入被检样品、阳性对照、阴性对照各 200 L，颠倒混匀，室 温静置 5 min； 4 10 000 g 离心 10 min。 7.1.1.3 取 900 L 上清，转入新的无菌无 DNA 酶 1.5 mL 离心管中，加入 500 L 预冷的无水乙醇，颠倒 混匀，室温放置 3 min； 4 10 000 g 离心 5 m
11、in。 7.1.1.4 弃上清，沿管壁缓慢加入 1 mL-20 普通冰箱中预冷的 75 %乙醇，颠倒混匀， 4 10 000 g 离 心 5 min。重复洗涤 2 次后，将离心管倒扣于吸水纸上，自然晾干或用移液器小心移去残液。 7.1.1.5 用 50 L 8 mmol/L NaOH 溶液溶解沉淀， DNA 在 -20 以下保存备用。 7.1.2 核酸提取仪提取 7.1.2.1 按照与核酸提取仪匹配的核酸提取试剂盒说明书提取。 7.1.2.2 将提取的 DNA 转入新的无菌无 DNA 酶的 1.5 mL 离心管中，在 -20以下普通冰箱中保存备用。 7.2 荧光 qPCR 检测 7.2.1 反
12、应体系的配制和分装 在试剂配制区进行。 gD基因和 gE基因的反应体系相同。设荧光 qPCR反应管数为 n， n为待检样品数 + 阳性对照管数 +阴性对照管数，每个反应体系见表 1，配制体系时建议按照 n+1个反应进行配制，配制反 应体系建议在冰盒中进行；配制好的反应液充分混匀后，按照每管 18 L 分装于 PCR反应管内，并做好 标识。 表 1 每个反应体系配制表 组 分 用量 2 TaqMan Fast qPCR Master Mix 10 L 上游特异性 PCR引物（ 10 mol/L） 0.5 L 下游特异性 PCR引物（ 10 mol/L） 0.5 L TaqMan探针（ 10 mo
13、l/L） 0.5 L 灭菌双蒸水 6.5 L 总体积 18 L 7.2.2 加样 DB21/T 3273 2020 4 在核酸提取区进行。每个反应管中按顺序分别加入 2 L待检样品、阳性对照、 阴性对照 DNA溶液， 盖好盖子后， PCR微量离心机瞬时离心 30 s，转移至 PCR扩增区。 7.2.3 qPCR 扩增检测 在 PCR扩增区 进行。 7.2.3.1 荧光通道 将 PCR反应管放入荧光 PCR仪内，设置探针： 5端选择 FAM荧光通道， 3端选择无（ none）荧光。 7.2.3.2 荧光 qPCR 反应条件 gD和 gE基因荧光 qPCR反应条件均为： 94 3 min； 94
14、15 s， 60 45 s，收集荧光， 40 个循环。 8 结果判定 8.1 阈值设定 阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增的最高点为准。 8.2 质量控制 8.2.1 阴性对照无 Ct 值，且无典型的 S 型扩增曲线。 8.2.2 阳性对照 FAM 通道 Ct 值 30，且扩增曲线为典型的 S 型。 8.2.3 以上要求需在同一次实验中同 时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。 8.3 结果描述及判定 8.3.1 gD 基因检测结果 8.3.1.1 阴性 无 Ct值或 Ct值 38，且无典型的 S型扩增曲线，报告为 PRV核酸阴性。 8.3.1.2 阳性
15、Ct值 36，且扩增曲线为典型的 S型，报告为 PRV核酸阳性，但需进一步经 gE基因检测来进行 PRV野 毒与疫苗毒的鉴别检测。 8.3.1.3 可疑 36 Ct值 38，判定为可疑，需从提取 DNA开始进行一次重复检测。如重复检测结果仍为 36 Ct值 38，且扩增曲线均呈典型的 S型扩增曲线，报告为 PRV核酸阳性，但需进一步经 gE基因检测来进行 PRV 野毒与疫苗毒的鉴别检测。 8.3.2 gE 基因检测结果 8.3.2.1 阴性 无 Ct值或 Ct值 38，且无典型的 S型扩增曲线，报告为 PRV野毒核酸阴性。 DB21/T 3273 2020 5 8.3.2.2 阳性 Ct值 3
16、6，且扩增曲线为典型的 S型，报告为 PRV野毒核酸阳性。 8.3.2.3 可疑 36 Ct值 38，判定为可疑，需从提取 DNA开始进行一次重复检测。如重复检测结果仍为 36 Ct值 38，且扩增曲线均呈典型的 S型扩增曲线，报告为 PRV野毒核酸阳性。 8.3.3 鉴别方法 针对缺失包含 gE基因在内的 PRV活疫苗免疫猪只，如果 gE基因检测阳性，则判定为 PRV野毒核酸阳性； 如果 gD基因检测阳性而 gE基因检测阴性，则判定为 PRV疫苗 毒阳性；如果 gD基因和 gE基因检测均为阴性， 则判定为 PRV核酸阴性，既无 PRV野毒也无疫苗毒。针对未免疫缺失 gE基因的 PRV疫苗（
17、gE/PRV）的猪 只，如果 gD基因或 gE基因检测结果为阳性，则判定为 PRV野毒核酸阳性；如果 gD基因和 gE基因检测均为 阴性，则判定为 PRV核酸阴性。 DB21/T 3273 2020 6 A A 附 录 A （规范性附录） 溶液配制 A.1 8 mmol/L NaOH溶液的配制 称量 0.32 g NaOH，溶解到 1 000 mL灭菌去离子水中，混匀，分装，常温保存。 A.2 0.02 mol/L pH7.2 磷酸盐缓冲液（ PBS）的配制 A.2.1 0.2 mol/L磷酸氢二钠溶液：称取磷酸氢二钠（ Na2HPO412H2O） 71.64 g，先加适量去离子水溶 解，最后
18、定容至 1000mL，混匀。 A.2.2 0.2 mol/L磷酸二氢钠溶液：称取磷酸二氢钠（ NaH2PO42H2O） 31.21 g，先加适量去离子水溶 解，最后定容至 1000 mL，混匀。 A.2.3 量取 0.2 moL/L磷酸氢二钠溶液 360 mL， 0.2mol/L磷酸二氢钠溶液 140 mL，称取氯化钠 38 g，用 无离子水溶解稀释至 5000 mL， 4保存。 DB21/T 3273 2020 7 B B 附 录 B （规范性附录） 引物和探针 名称 序列（ 5 -3 ） gD-qF（上游引物） GTTCAACGAGGGCCAGTACC gD-qR（下游引物） CGGCGTCAGGAATCGCATCA gD-P（探针） FAM-ACCAGCACCGCACGTACAAG-BHQ1 gE-qF（上游引物） CCGAGGACGAGTTCAGCA gE-qR（下游引物） GGCCCATTCGTCACTTCCG gE-P（探针） FAM-ACCAGACGTCGAAGCCGGA-BHQ1 注：引物和探针均由生物公司合成，用无菌无核酸酶水配制成 10 mol/L工作液， -20 以下普通冰箱中保存供检 测用。 _
