1、ICS 67.120.30 B 51 DB21 辽宁省 地 方 标 准 DB21/T 3105 2019 中国蛤蜊（种质） Species identification of Mactra chinensis 2019 - 01 - 30 发布 2019 - 03 - 01 实施 辽宁省市场监督管理局 发布 DB21/T 3105 2019 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1 2009标准化工作导则 第 1部分：标准化工作导则给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由丹东市质量技术监督局提出。 本标准由辽宁省 农业农村厅 归
2、口。 本标准起草单位：丹东永明食品有限公司、中国科学院海洋研究所。 本标准主要起草人：张涛、宋浩、李永明、李朝辉、杨靖华、胡博、杨红生、周毅、张立斌。 DB21/T 3105 2019 1 中国蛤蜊（种质） 1 范围 本标准规范了中国蛤蜊 Mactra chinensis（ Philippi， 1846）的名称与分类、分布、主要形态特征、 生长与繁殖、遗传学特性、检测方法和判定规则。 本标准适用于辽宁地区中国蛤蜊种质检测与鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）
3、适用于本文件。 GB/T 18654.2 养殖鱼类种质检验 第 2部分：抽样方法 GB/T 18654.12 养殖鱼类种质检验 第 12部分：染色体组型分析 DB21/T 1958-2012 水产动物 DNA鉴定线粒体 COI基因序列法 3 名称与分类 3.1 名称 中国蛤蜊 Mactra chinensis（ Philippi， 1846），别名黄蚬子、飞蛤、沙蛤、中华蛤蜊、凹线蛤蜊 。 3.2 分类 地位 软体动物门（ Mollusca）、双壳纲（ Bivalvia）、帘蛤目（ Veneroida）、蛤蜊科（ Mactrida）、 蛤蜊属（ Mactra）。 4 分布 中国蛤蜊为暖温性种类
4、。栖息于中潮区至水深 60 m浅海的细砂中，以水深 2 m 5 m处最多。主要分 布在我国的辽宁、山东，日本、朝鲜也有分布。 5 主要形态特征 5.1 外部形态特征 5.1.1 贝壳外形 贝壳略呈三角形，壳较坚厚。壳长略大于壳高，两壳大小相等。壳面膨胀，无放射肋，但由壳顶至 腹缘有宽度不等的浅黄色与黄褐色相间的放射带或放射条纹。壳面同心状，生长纹明显，愈近腹缘生长 纹愈粗大。壳顶稍突出，略高出背缘，位于背缘中央稍偏前方，向内弯曲，不接触。小月面及楯面宽大。 壳前后缘均圆形，背腹缘呈弧形。 DB21/T 3105 2019 2 5.1.2 色泽 壳面黄褐色。壳内面银白色，壳 顶内面为蓝紫色，幼贝
5、更加明显。 5.1.3 绞合部 左右两壳各具一主齿，左主齿呈“人”字形，右主齿呈“八”字形。左壳前后方各 1齿，单片，右 壳前后方齿为双片。内韧带槽位于壳顶基部，内嵌有褐色三角形的内韧带，位于主齿后方。 5.1.4 闭壳肌痕 后闭壳肌痕略大于前闭壳肌痕，在前后闭壳肌上方各有一缩足肌痕。 5.1.5 外套肌痕 外套窦深而钝。外套肌痕宽短。 中国蛤蜊外部形态见图 1。 图 1 中国蛤蜊 形态特征 5.2 软体部 5.2.1 外套膜与水管 外套膜包围整个软体部，边缘厚 ,中央薄而透明 ,在背缘愈合，并在后缘愈合形成两个水管。水管短 而粗 ,两个水管紧靠 ,但互不相通。 出水管较进水管细而短 ,于进水
6、管之上。 5.2.2 足 位于身体腹面 ,两侧扁平呈斧刀状 ,颜色为白色或淡红色。 5.2.3 闭壳肌 后闭壳肌大于前闭壳肌 ,略呈方柱形体，前闭壳肌近圆柱体，前后闭壳肌上方各有一缩足肌。 5.2.4 鳃 身体左右各有鳃两片，内外鳃形状不同 ,外鳃小于内鳃，内外鳃在背缘与内脏囊相连，内鳃的前端 与唇瓣相接，两侧鳃的基部在身体后部末端愈合 。 5.2.5 内脏团 DB21/T 3105 2019 3 由肝胰脏、心脏、生殖腺、胃等构成，被外套膜和鳃包围 。 6 生长与繁殖 6.1 生长 自然 条件下， 1龄 壳壳 长可达 20 mm 30 mm。 4龄或 5龄时， 壳 长 可达 50 mm 60
7、mm。中国蛤蜊年龄、 壳长、体重之间的关系见 表 1。 表 1 中国蛤蜊年龄 、壳长、体重之间的关系 年龄 (年 ) 壳长 (mm) 体重 (g) 1 30 3.0 2 30 50 3.0 20 3 50 16.7 25 4 60 38.46 50 5 60 38.46 50 6.2 繁殖 6.2.1 性成熟年龄 最小生物学 年龄 为 1年 。 6.2.2 繁殖方式 雌雄异体 ,体外受精。极少数个体会发生性逆转 ,出现雌雄同体现象。 6.2.3 繁殖期 每年只有一个繁殖期，繁殖盛期为 5月中旬 8月上旬。其繁殖季节随着地理区域不同而存在差异 , 主要受水温影响。 6.2.4 排精、产 卵习性
8、水温 14 以上时，可以排精、产卵 。 排精和产卵时亲贝双壳微张，配子从出水管缓缓排出。精子 乳白色呈烟雾状 ,卵子粉红色呈丝缕状。分批产卵，壳长 45 mm的雌性个体， 1次产卵量在 70万粒 200 万粒左右。卵沉性，排入水中的卵细胞不能立即自行散开。 6.2.5 精卵特征 卵子呈圆球状，核较小而居中。卵径 46 m 61 m， 卵核径 20 m左右。精子头部 1.O m l.7 m， 尾部细长，为头部的 1.0倍 1.5倍。受精后进行不等全卵裂，从四细胞起为螺旋卵裂。 7 遗传 学 特性 7.1 染色体数目 中国蛤蜊二倍体体细胞染色体数为： 2n=38。 DB21/T 3105 2019
9、 4 7.2 16S rRNA、 ITS2 和 COI 基因片段 分子特征 7.2.1 线粒体 16S rRNA 基因片段单倍型序列位点 片段长度为 322bp， 检测特征 见图 2，片段的单倍型序列位点为： “ TAGTAGCGCAATAAATTGTCCTTTAATTGGGGAAATGAATGAAAGGGTTGACGAGGGGGAAGCTATCTTTTTGGTATAGTTTG AAGTTTTCTTTTATGTGAAAAGACTTAGATTTTATAATTAGAAGAGAAGACCCCGGCGAGCTTGTTAAGGGTTACTAAGTTGAGGTAAT TATTGATTTTTGTTGGGGC
10、AACGCAAAGGGAAAAGAACTCCTTTGAGTTTTATAGGGATCCACTTAGAGTGAACAAAGCAAAAGCTACC GCGGGGATAACAGCGCAATTTCTTCAGAGAGCTCATATCGAAGAGGAAGGTTGCGACCTCG”。 图 2 中国蛤蜊 肌肉组织 16S rRNA 基因片段 凝胶电泳图谱 7.2.2 ITS2 基因片段单倍型序列位点 片段长度为 590bp， 检测特征 见图 3，片段的单倍型序列位点为： “ ATCGACATCTTGAACGCATATTGCGGCTCCGGCTCAATGCCGAAGCCCCGCCTGTCCGAGGGTAGGCTA
11、AACATAATCGCCCG TATCTGCCTGTCGAGGCACCGTTTCATTACGGTGAATCCAGCGCAGGGGCGACTTGGCGTTTCGCGCGAGCCTGTCTCGCCCGTTCGCT CGAGCTCTCCGCTCTCCCAGCAGGCCAACTCATTCAGTGGCGCAGGGACTGGGCCCGATCGGATCCAGTCTACCGTAGCTATCTGAAGG TCTCGCTGCGTTCTGCCGCCGTCCCTCTCGCCTCTTCGTGAGGCTCGATCGAGGTTGATGGCCACGACTAGCGCAACCGGCTCGATGTA CAGCACTCTCACTGC
12、GGCTTACCAGCCGCGGAGGTCGAGGAGCACCACGTCGCCGGGGAGTAACCCGTTCTCGCTCACTAGTTCGCTAG TAGCAGCTCGGGTTTGCGCGGTCTGTGCTTGGGGCAAGGAGCGGGCACCCAACCTATTCACTAGGTGAGTAGGCGGCGCACATAGTATA AAACAACCTACCTCGGATCAGACGAGACTACCCGCTGAATTTAAGCATATCAGTAAGCGGAG”。 图 3 中国蛤蜊 肌肉组织 ITS2 基因片段 凝胶电泳图谱 7.2.3 COI 基因片段分子特征 片段长度为 627bp，检测特征见图 3
13、，片段的单倍型序列位点为 : CATAAAGATATTGGCACTCTTTATTTCGTCTTTTCTTATTGGGCTGGGTTGGTAGGAACAGCTTTTAGCTCTATTATTCGTTTAG AGTTAGCTGTTCCTGGTGAGAGTCTTTTAGATGGGCAGCTTTATAATTTAGTTGTGACGGCGCATGCTTTAGTTATAATTTTTTTTTTA GTGATGCCAATAATGATGGGGGGTTTTGGGAATTGGTTAGTTCCTCTAATGTTAAAAGTTCCAGATATGAGGTTTCCTCGTATGAACAA TATTAGGTTCTGACTTCTT
14、CCTGTTTCTATTTTACTTCTATTTGCTTCGGCCTATGTTGAAAGAGGGGCAGGAACTGGTTGAACCATTT ATCCTCCTCTGTCTAGGCATATAGGACATCCTGGACCGGCTATGGATTATGTTATTTTTTCTCTCCACGTAGGTGGTCTTTCTTCGATC DB21/T 3105 2019 5 CTAGCATCTATTAATTTCTTTACAACTTTCCTAAGGATACGACTAAAGGTGATGTCTTTATATCGGGTTCCTTTGTTTGTTTGATGTAT TGCTGTAACTAGGTTCTTGTTAGTAGTTGC
15、TATACCTGTTTTGGCTGGCGCTCTTACTATGTTGTTAACAGATCGGAATTTCAATACTT CTTTTTTT。 图 4 中国蛤蜊 肌肉组织 COI 基因片段 凝胶电泳图谱 8 检测方法 8.1 抽样 按 GB/T 18654.2的规定执行。 8.2 染色体和核型检测 8.2.1 染色体标本制备 参 见 GB/T 18654.12的规定执行 。 8.2.2 核型分析 观察 100个左右的分散良好的中期分裂相，记数确定二倍体数。从中挑选 10个分散良好、形态清晰 的中期分裂相进行显微摄影、放大、测量，按 GB/T 18654.12的分类标准对染色体分类。 8.3 线粒体
16、基因片段分子特征检测 COI基因片段分子特征检测参照 DB21/T 1958-2012执行。 16S rRNA和 ITS2基因片段分子特征检测如下。 8.3.1 DNA 提取 取足肌肉 30 mg，剪碎至糜状，使用 DNA提取试剂盒提取基因组 DNA。 8.3.2 引物序列 以中国蛤蜊基因组 DNA为模板，分别用无脊椎动物 16S rRNA和 ITS2基因序列通用引物进行扩增。引 物序列见表 1。 表 1 引物序列 DB21/T 3105 2019 6 16S3L 5 -TGAGCGTGCTAAGGTAGC-3 16S4H 5 -AGCCAACATCGAGGTCGC-3 ITS2 forwar
17、d primer 5 -CACACTGAACATCGACAGCTTG-3 ITS2 reverse primer 5 - GTTTCTTTTCCTCCGCTTACTG-3 8.3.3 PCR 反应体系 25 L PCR反应 体系组分 见表 2、 3。 表 2 25L 16SrRNA 基因 PCR 反应 体系组分 PCR Mix 12.5 L 16S3L (10 M) 0.5 L 16S4H（ 10 M ） 0.5 L DNA 模板 (100 ng/L) 1 L H2O 10.5 L 表 3 25L ITS2 基因 PCR 反应 体系组分 PCR Mix 12.5 L ITS2 forward
18、primer (10 M) 0.5 L ITS2 reverse primer（ 10 M ） 0.5 L DNA 模板 (100 ng/L) 1 L H2O 10.5 L 8.3.4 PCR 程序 8.3.4.1 16S rRNA 基因 PCR 程序 95 预变性 5 min，之后 30个循环（ 95 变性 30 s， 50 退火 50 s， 72 延伸 50 s），经 72 延伸， 10 min后 15 保存。 8.3.4.2 ITS2 基因 PCR 程序 95 预变性 5 min，之后 30个循环（ 95 变性 50 sec， 48 退火 50 sec， 72 延伸 1 min），经 7
19、2 延伸， 10 min后 15 保存 。 8.3.5 琼脂糖 凝胶电泳 8.3.5.1 TAE（ 凝胶缓冲液和电泳缓冲液 ） 的制备 Tris 242 g， Na2EDTA 2H2O 18.6 g， 800 mL去离子水， 57.1 mL的冰乙酸，用 NaOH调 pH至 8.3，去 离子水定容至 1 L。 使用时稀释 50倍。 8.3.5.2 分析样品的制备 电泳前取 2 L PCR产物与 0.8 L 的上样缓冲液混合后 备电泳用。 8.3.5.3 凝胶制备 DB21/T 3105 2019 7 加 琼脂糖 4 g和制胶缓冲液 （ TAE） 400 mL，在三角烧瓶内混匀，加热至沸腾，然后注
20、入制胶模具中。 冷却后，保鲜膜密封保存备用。 8.3.5.4 电泳步骤 将 Marker和 PCR产物加入点样孔， 上样完毕后，在 室温 条件下以 120 V 150 V电压 进行电泳，电泳 时间依 线粒体基因片段 的 不同 而不同 ，当 PCR产物跑至凝胶 1/2 2/3处即可 。 8.3.5.5 染色 电泳结束后，将 琼脂糖 凝胶 水平 置于 盛有 3 %EB的染色液的 染色盒中进行染色 ，染色 15 min左右 。 8.3.5.6 摄影、扫描 用 凝胶成像系统对谱带进行显像和拍照。 8.3.5.7 结果分析 将所得 PCR产物进行纯化回收，采用双向测序并对测序结 果进行人工校对。 9 判定规则 被检样品符合本标准的第 5章、第 6章和第 7章要求的为合格样品。如果有一项不符合的可以复检， 复检不合格的判定为不合格，复检合格的判定为合格。合格样品数与样品总数的比为合格率。 _
