1、ICS 11.220 B 41 DB15 内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准 DB 15T 98 2020 代替 DB15/T 98-1993 羊快疫、肠毒血症、猝狙防制技术规程 Prevention technical specifications for Braxy, enterotoxemia, struck 2020-07-30发布 2020-08-30实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发布 DB 15/T 98 2020 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准代替了 DB15/T 98-1993羊快疫、肠毒血症、猝狙防制技术规程，与 DB15
2、/T 98-1993 相 比，除编辑性修改外主要技术变化如下： 修改了诊断技术及防制措施 （见 2， 1993 版的 2） ； 删除了扑灭标准及消灭标准 （见 1993 版的 4） 。 本标准由内蒙古自治区农牧厅归口。 本标准起草单位：内蒙古自治区动物疫病预防控制中心。 本标准主要起草人：郭宇、马立峰、萨茹拉、申捷、张伶俐、贾皓、苏胜杰、云涛、戴晓光、王永 杰、特木尔巴根、武娅楠、赵心力。 本标准的历次版本发布情况为： DB15/T 98 1993。 DB 15/T 98 2020 1 羊快疫 、肠毒血症、猝狙 防制技术规程 1 范 围 本标准规定了羊快疫、肠毒血症、猝狙的诊断技术、预防措施、
3、疫病控制措施和标准。 本标准适用于内蒙古自治区境内饲养、经营、运输、屠宰、加工羊只的单位和个人。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 NY/T 3073 家畜魏氏梭菌病诊断技术 3 诊 断技术 3.1 羊快疫 3.1.1 流行特点 羊快疫是由腐败梭菌引起，以真胃黏膜出血性、坏死性炎症为特征的羊 的一种急性传染病。营养中 等、 6 18月龄的绵羊最易感。山羊也有发生。有低洼草地、熟耕地及沼泽地放牧史。 3.1.2 临 诊诊断 病羊多无临床症状，突然死亡
4、。病程稍缓者，表现为不愿行走，运动失调，腹痛，腹泻，磨牙抽搐， 最后衰弱昏迷，口流带血泡沫，多于数小时内死亡。 3.1.3 病理 变化 尸体迅速腐败膨胀，可见黏膜充血呈暗紫色；真胃及十二指肠黏膜有明显的充血、出血；黏膜下组 织水肿甚至形成溃疡；胸腔、腹腔、心包有大量积液，暴露于空气易于凝固；心内膜、心外膜有点状出 血；肝脏肿大、质脆，呈煮熟状；胆囊胀大，充满胆汁。 3.1.4 实验室诊断 3.1.4.1 涂片 、镜检 用清洁玻片在病死畜肝被膜进行组织触片，瑞氏染色镜检，除见有单在或短链的粗大杆菌外，还可 见无关节的长丝状菌体；用革兰氏染色镜检，可发现大量革兰氏阳性典型丝状菌体。 3.1.4.2
5、 分离培养和鉴定 采集病死羊肝脏及肠内容物，无菌接种到葡萄糖鲜血琼脂平板上， 37 厌氧培养 24 h，形成微隆 起的、边缘厚薄不均的淡灰色菌落，菌落周围有微弱的溶血区。挑取单个菌落进行纯培养，并将纯培养 DB 15/T 98 2020 2 物接种于厌氧肉肝汤中， 37 厌氧培养 24 h 后，肉汤均匀混浊，且有白色絮片状沉淀存在于管底，并 产生腐败味气体。挑取纯培养物进行生化实验，该菌能 发酵葡萄糖、麦芽糖、水杨素、乳糖，不发酵蔗 糖。 3.1.4.3 动物试验 取患病动物的血液或者病料制成的乳剂肌肉注射于小白鼠， 24 h 后死亡。迅速采取死亡小白鼠的 肝脏涂片、染色、镜检，可见两端钝圆的
6、粗大杆菌外，还可见无关节的长丝状菌体。 3.2 羊肠毒血症 3.2.1 流行特点 羊肠毒血症是由 D 型产气荚膜梭菌在羊肠道中大量繁殖产生毒素所引起，以腹泻、惊厥、麻痹和突 然死亡、死后肾组织软化为特征的一种急性传染病。各种品种、年龄的羊都可感染发病，多呈散发，绵 羊较山羊多发。 2 月 12 月龄且膘情较好的羊最易发病。在牧区，多发于春夏之交、抢青时和秋季 牧草 结籽后；在农区，多发于收割抢茬季节或采食了大量谷类之后，流行具有明显的地方性。 3.2.2 临诊 诊断 3.2.2.1 抽搦型 突然发作。倒毙前，四肢出现强烈的划动，肌肉颤搐，眼球转动，磨牙，口水过多，随后头颈显 著抽缩，常于 2
7、h 4 h 内死亡。 3.2.2.2 昏迷沉 睡 型 早期为步态不稳，以后卧倒，并有感觉过敏、流涎，上下颌“咯咯”作响，继而昏迷，角膜反射 消失，有的病羊发生腹泻，常在 3 h 4 h 内安静地死去。 3.2.3 病理 变化 肠道（尤其小肠）黏膜充血、出血，重症病例整个肠壁呈血红色，有时出现溃疡；心包常扩大，内 含灰黄色液体和纤维素絮块，左心室的 心内外膜下有点状出血；肺脏出血和水肿；胸腺出血；死后肾脏 软化如泥样。全身淋巴结肿大、出血。 3.2.4 实验室诊断 3.2.4.1 涂片、镜检 用清洁玻片在病死畜肠道病变部位黏膜、肾脏或淋巴结进行组织触片，革兰氏染色镜检，可发现大 量革兰氏阳性、两
8、端钝圆、边缘整齐有荚膜、单个或成双排列、偶见有芽孢的大杆菌。 3.2.4.2 分离培养和鉴定 将采集的病死畜心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、空肠肠壁病料，无菌接种到血琼脂培养基， 43 厌氧培养 24 h，培养皿中可见 2.0 mm 3.0 mm 表面光滑、半透明双溶血菌落。将可疑菌落接种于肉汤 进行增殖培养后接种于含 铁牛乳培养基，在 46 水浴中培养 2 h 出现典型的“暴烈发酵”现象。 3.2.4.3 毒素检查和中和试验 DB 15/T 98 2020 3 取回肠内容物，经离心沉淀后取上清液分成两份，一份不加热，一份 60 30 min 处理，分别给 小鼠静脉注射 0.1 mL 0.3 m
9、L，若加热组小鼠不死亡，而不加热组小鼠死亡即证明有毒素存在。然后 进一步进行毒素中和保护试验，可检测到 D 型产气荚膜梭菌毒素。 3.2.4.4 产气荚膜梭菌毒素基因的 PCR检测 3.2.4.4.1 器材 厌氧培养箱、生物安全柜、 PCR 仪、电泳仪、凝胶成像仪、恒温水浴锅、振荡器、离心机、高压灭 菌锅。 3.2.4.4.2 培养基和试剂 血琼脂平板、增菌 培养基、 Taq 酶、 DNA 模板、 dNTPs 水、双蒸水。 3.2.4.4.3 DNA模板的制备 3.2.4.4.3.1 组织样品 制备 取约 0.2 g 的待检组织样品于灭菌干燥的研钵中充分研磨，加 1 mL PBS（含青霉素或链
10、霉素）混 匀 3000 r/min 离心 5 min 取上清，转入无菌的 1.5 mL 离心管中，样本在 2 8 条件下保存，应 不超过 24 h。若需长期保存，应放在 -70 以下冰箱，但应避免反复冻融。 3.2.4.4.3.2 增菌 培养物制备 将分离鉴定的产气荚膜梭菌接种于肉汤培养基中， 43 厌氧培养 12 h。 3.2.4.4.3.3 试剂盒 法 取处理好的增菌培养物或组织样品，使用商品化的 DNA 提取试剂盒提取 DNA 做为模板， DNA 模板 可置于 -20 保存备用。 3.2.4.4.4 PCR 反应体系 PCR 反应体系见表 1。 表 1 PCR 反应体系（总体积为 25
11、L） PCR 反应管中依次加入上述成分，充分混匀后，瞬时离心 ，确保所有反应成分混匀并集于管底 。 10 Taq buffer(含 Mg2+) 2.5 L dNTPs 2.5 L 上游和下游引物 (10 pmol/L) 各 1 L 模板 2 L 无菌双蒸水 15.75 L Taq DNA 聚合酶 0.25 L DB 15/T 98 2020 4 3.2.4.4.5 PCR 对照 设立阳性对照、阴性对照和空白对照，用 D 型 、 C 型产气荚膜梭菌 标准菌株的菌体做阳性对照，用 大肠杆菌标准菌株的菌体做阴性对照，用无菌双蒸水做空白对照。 3.2.4.4.6 PCR 扩增程序 将上述加有 DNA
12、模板的 PCR 管，置于 PCR 仪内进行反应。反应条件如下： 94 变性 5 min， 然后 进行 30 个循环 的扩增（ 94 变性 30 s； 53 退火 30 s； 72 延伸 1 min） ， 最后 72 延伸 10 min， 4 保存。 3.2.4.4.7 电泳 用 TAE(配制方法见附录 A)制备 1 %琼脂糖凝胶，加样 6 L 8 L， 在电压 80 V-100 V、电流 40 mA 下进行电泳 30 min 40 min。 3.2.4.4.8 结果判定 3.2.4.4.8.1 试验成立的条件 当阴性对照 和空白对照 不出现条带、阳性对照出现 清晰条带 ，试验成立。 （参 照
13、附录 B 进行判定 ) 3.2.4.4.8.2 判定 D 型产气荚膜梭菌：电泳同时出现 a325bp、 656bp 共 2 条带。 C 型产气荚膜梭菌：电泳同时出现 a325bp、 196bp 共 2 条带。 3.3 羊猝狙 3.3.1 流行特点 羊猝狙是由 C 型产气荚膜梭菌毒素所引起，以溃疡性肠炎和腹膜炎为特征的羊的一种急性传染病。 成年绵羊，尤其 1 2 岁者多发。山羊也有发生。常见于低洼 、沼泽地区。多发生于冬、春季节。主要 经消化道感染，常呈地方流行性。 3.3.2 临 诊诊断 病程短促，常未及见到症状即突然死亡。有时发现病羊掉群、卧地，表现不安、衰弱、痉挛、眼球 突出，在数小时内死
14、亡。 3.3.3 病理 变化 十二指肠和空肠黏膜严重充血、糜烂，有的区段可见大小不等的溃疡；胸腔、腹腔和心包大量积液， 后者暴露于空气后，可形成纤维素絮块；病羊刚死时骨骼肌表现正常，但在死后 8h 内，肌间隔积聚血 样液体，肌肉出血，有气性裂孔。 3.3.4 实验室诊断 3.3.4.1 涂片、镜检 具体方法同 3.2.4.1 。 3.3.4.2 分离培养和鉴定 具体方法同 3.2.4.2 。 DB 15/T 98 2020 5 3.3.4.3 用 小肠内容物滤液接种小鼠进行毒素检查和中和试验 (具体方法同 3.2.4.3)，可检测到 C 型 产气荚膜梭菌毒素。 3.3.4.4 产气荚膜梭菌毒素
15、基因的 PCR 检测 具体方法同 3.2.4.4。 4 预防 措施 4.1 加强饲养管理，科学进行饲喂。不饲喂来源于低洼草地、熟耕地及沼泽地等易被梭菌及其毒素污 染的饲草和饮水；牧区夏初发病时，应少抢青，多在青草萌发较迟的地方放牧，秋末宜到草黄较迟的地 方放牧；在农区减少抢茬，少喂菜根菜叶等多汁饲料。 4.2 在本病常发地，每年定期注射“羊快疫 -肠毒血症 -猝狙三联苗”，或“羊快疫 -肠毒血症 -猝狙 -羔 羊痢疾 -黑疫五联苗” 。 5 疫病控制 措施和标准 5.1 疫病控制措施 5.1.1 羊快疫、 肠毒血症 、 猝狙发生、流行时，可立即转 群 ，牧区要转移到高燥的地区放牧。同群羊 只及
16、周围羊群应做好紧急预防注射。 5.1.2 发病时，应将病羊及时隔离 ， 对病程较长的病羊用青霉素、磺胺嘧啶等抗菌药物进行治疗 。 5.1.3 被污染的场地、棚圈、卧盘和用具可用卤素类、碱类或酚类等消毒药进行消毒，病畜不得屠宰 剥皮和吃肉。 5.2 疫病 控制 标准 连续两年内羊快疫、肠毒血症、猝狙发病率不超过全年饲养量的 0.05 %，即达到控制。 DB 15/T 98 2020 6 A A 附 录 A （规范性附录） PCR反应溶液的配制 50TAE 电泳缓冲储存 液 三羟 甲基 氨基甲烷（ Tris 碱 ） 乙二胺 四乙酸二钠（ Na2EDTA） 双蒸水 242 g 37.2 g 800
17、mL TAE 电泳缓冲液（ pH 约 8.5）的配制要求如下： 待上述混合物完全溶解后，加入 57.1 mL 的醋酸充分搅拌溶解，加双蒸水至 1 L 后，置 室 温保存。应用前，用无菌双蒸水将 50TAE 电泳缓冲液 50 倍稀释。 DB 15/T 98 2020 7 B B 附 录 B （资料性附录） PCR检测鉴定结果 B.1 PCR引物序列见表 B.1。 具体参照 NY/T3073 进行 诊断 。 表 B.1 PCR引物序列 基因 bp 上游引物 (5 七 3) 下游引物 (5-3) (alpha)cpa(325) GCTAATGTTACTGCCGTTGA CCTCTGATACATCGT
18、GTAAG (beta)cpb(196) GCGAATATGCTGAATCATCTA GCAGGAACATTAGTATATCTTC ( epsilon) etx( 656) GCGGTGATATCCATCTATTC CCACTTACTTGTCCTACTAAC (iota) iap(446) ACTACTCTCAGACAAGACAG CTTTCCTTCTATTACTATACG B.2 毒素基因 PCR检测结果见图 B. 1。 具体参照 NY/T 3073 进行 诊断 。 说明： M 一 2000 Marker 1 A 型标准株 NCTC 528（ ） 2 - 分离株 1; 3 - 分离株 2； 4 - 分离株 3； 5 - 分离 株 4 6 - 空白对照 ； 7 - 阴性对照； 8 - A 型阳性对照 （ ） 9 - C 型阳性对照（ 、 ） 图 B.1 毒素基因 PCR检测结果 _
