1、ICS 11.220 B 41 DB15 内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准 DB 15/T 99 2020 代替 DB15/T 99-1993 鸡白痢防制技术规程 Prevention technical specifications for pullorum disease 2020-07-30发布 2020-08-30实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发布 DB 15/T 99 2020 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1 2009给出的规则起草。 本标准代替了 DB15/T 99 1993鸡白痢病防制技术规程，与 DB15/T 99 1993相比，除编辑性修 改外主要技术变化
2、如下： 名称修 改为鸡白痢防制技术规程； 删除了扑灭标准及消灭标准（见 1993版的 4.1） ； 增加了净化标准的相关内容（见 4.2.2） ； 修改了诊断技术（见 2， 1993版的 2）。 本标准由内蒙古自治区农牧厅归口。 本标准起草单位：内蒙古自治区动物疫病预防控制中心。 本标准主要起草人：萨茹拉、马立峰、郭宇、申捷、张伶俐、贾皓、云涛、苏胜杰、戴晓光、王永 杰、特木尔巴根、武娅楠、赵心力。 本标准的历次版本发布情况为： DB15/T 99 1993。 DB 15/T 99 2020 1 鸡白痢防制技术规程 1 范围 本 标准 规定了鸡白痢的诊断技术、防制措施 和净化措施 。 本 标准
3、 适用于饲养、经营、运输、屠宰、加工鸡（火鸡）的单位和个人。 2 诊断技术 2.1 流行特点 鸡白痢是由鸡白痢沙门菌引起的一种不同品种、不同日龄的鸡均易感的传染病。本病的传染源主要 是病鸡和带菌鸡，有水平传播和垂直传播多种途径，三周龄内雏鸡发病率和病死率高。 2.2 临诊诊断 2.2.1 雏鸡 潜伏期一般为 4 d 7 d。 病雏表现为怕冷、精神沉郁、昏睡、羽毛逆立，排出白色粘稠或淡黄色、 淡绿色稀便，羽毛与肛门周围不洁。少数出现呼吸困难、关节肿 胀、失明等症状，最后衰竭死亡。 2.2.2 育成鸡及成年鸡 多呈慢性或隐性感染，症状不明显，表现为因卵黄囊炎引起的腹膜炎，腹膜增生而呈“垂腹”现象，
4、 母鸡产蛋量与受精率下降。 2.3 病理变化 2.3.1 雏鸡 多呈急性死亡，病理变化不明显。病程稍长呈现心肌、肺、肝、盲肠、大肠及肌胃肌肉中有坏死灶 或结节，胆囊肿大，输尿管扩张等病理变化。盲肠中有干酪样物，常有腹膜炎。稍大的病雏有出血性肺 炎，肺部有灰黄色结节。 2.3.2 育成鸡 肝肿大，呈现暗红色或深紫色，表面可见散在或弥散性的小红色或黄白色大小不一的坏死灶，质地 极脆，常见有出血变化。 2.3.3 成年鸡 成年母鸡常见为卵子变形、变色、呈现囊状，有腹膜炎及腹腔脏器粘连，常有心包炎。成年公鸡睾 丸极度萎缩，输精管腔增大，充满稠密的均质渗出物。 2.4 实验室诊断 2.4.1 细菌分离鉴
5、定 DB 15/T 99 2020 2 2.4.1.1 采集病料 无菌采集被检鸡的肝、脾、肺、卵巢等脏器，取脏器组织 5 g 10 g，研磨后进行病原分离培养。 2.4.2 分离培养 2.4.2.1 试剂 增菌培养基：亚硒酸盐煌绿增菌培养基、四硫磺酸钠煌绿增菌培养基。 鉴别培养基： SS琼脂、麦康 凯琼脂 。 2.4.2.2 操作 将研磨的病料分别接种在亚硒酸盐煌绿增菌培养基、四硫磺酸钠煌绿增菌培养基、 SS 琼脂或麦康 凯琼脂培养基平皿上， 37 培养 24 h 48 h，在 SS琼脂或麦康凯琼脂培养基平皿上若出现白色或半透 明、圆形的光滑菌落，判定为可疑菌落。若在鉴别培养基上无可疑菌落出现
6、时，应从增菌培养基中取 菌液在鉴别培养基上划线分离， 37 培养 24 h 48 h，若有可疑菌落出现，则进一步做鉴定。 2.4.2.3 病原鉴定 2.4.2.3.1 生化试验和运动性检查 2.4.2.3.1.1 试剂 三糖铁琼脂和半固体琼脂。 2.4.2.3.1.2 操作 将可疑菌落穿刺接种在三糖铁琼脂斜面，并在斜面上划线，同时接种在半固体培养基， 37 培养 24 h 后观察。 2.4.2.3.1.3 结果判定 若无运动性，并在三糖铁琼脂上出现阳性反应时，则进一步做血清学鉴定；若有运动性，说 明不是 鸡白痢沙门菌感染。 三糖铁琼脂典型阳性反应为斜面产碱、变红，底层产酸、变黄；部分菌株斜面和
7、底层均产酸、变黄， 半固体琼脂阳性反应为穿刺线呈现毛刷状。 2.4.3 全血或血清平板凝集试验 2.4.3.1 试剂 鸡白痢多价染色平板抗原、强阳性血清（ 500 IU/mL）、弱阳性血清（ 10 IU/mL）、阴性血清。 2.4.3.2 器材 玻璃板、移液器、枪头等。 2.4.3.3 操作步骤 在 20 25 环境条件下，用移液器吸取抗原 30 L，垂直滴于玻璃板上，然后取被检鸡的全血 或分离后所得血清 30 L，与抗原混合均匀，并使其散开至直径约为 2 cm，计时判定结果。 同时，设置 强阳性对照、弱阳性对照和阴性血清对照。 DB 15/T 99 2020 3 2.4.3.4 结果判定 2
8、.4.3.4.1 凝集试验判定标准 100 %凝集（ +）：紫色凝集块大而明显，反应液清亮； 75 %凝集（ +）：紫色凝集块较明显，反应液有轻度浑浊； 50 %凝集（ +）：出现明显的紫色凝集颗粒，反应液较为浑浊； 25 %凝集（ +）：仅出现少量的细小颗粒，反应液浑浊； 2.4.3.4.2 0 %凝集（ -） 无凝集颗粒出现，反应液浑浊。 2.4.4 PCR检测 2.4.4.1 试剂 10 PCR Buffer、 dNTP、 Taq 酶、 DL2000DNA Marker、 乙醇、 DEPC 水、 TAE、 琼脂糖、阳性对 照（已鉴定的鸡白痢沙门菌）和阴性对照。 2.4.4.2 器材 1.
9、5mL灭菌离心管、恒温水浴锅、离心机、混匀器、电泳仪、 PCR仪、凝胶成像仪等。 2.4.4.3 DNA模板的制备 取灭菌的 1.5 mL 离心管，做好标识。每管加入 600 L 裂解液，分别加入被检样本（增菌培养物、 研磨好的组织上清）、阴性对照、阳性对照各 200 L，再加入 200 L 氯仿，混匀器上振荡混匀 5 s，于 4 12000 r/min 离心 15 min；取灭菌的 1.5 mL 离心管，加入 -20 预冷 400 L 异丙醇，吸取裂解好 的被检样本、阴性对照、阳性对照上清液转移至相应的管中，避免吸出中间层，颠倒混匀；于 4 12000 r/min 离心 15 min，弃上清
10、，倒置于吸水纸上，沾干液体，加入 600 L 75 %预冷乙醇，颠倒洗涤；于 4 12000 r/min 离心 15 min，弃上清，倒置于吸水纸上，沾干液体； 10000 r/min 离心 10 s，用微量加样器 将其吸干，室温干燥 5 10 min；加入 15 L DEPC 水，溶解管底的 DNA， 5000 r/min、 离心 5 s， -20 保存备用。 2.4.4.4 PCR反应体系 PCR反应体系见表 1。 表 1 PCR反应体系（总体积为 48 L） 无菌超纯水 34.75 L 10PCR Buffer（含 Mg2+） 5 L dNTP（ 2.5 mmol/L） 4 L speC
11、 上游引物（ 10 mol/L） 1 L speC 下游引物（ 10 mol/L） 1 L Taq 酶（ 5 U/L） 0.25 L DNA 模板 2 L DB 15/T 99 2020 4 2.4.4.5 PCR扩增程序 将上述加有 DNA模板的 PCR管，置于 PCR仪内进行反应。 PCR反应条件为： 95 预变性 5 min， 95 变 性 30 s， 56 退火 30 s， 72 延伸 30 s， 30个循环， 72 延伸 7 min。 2.4.4.6 电泳 用 TAE（ 配制方法见附录 A） 制备 1.5 % 2.0 %的 琼脂糖凝胶，加样 6 L 8 L， 在电压 80 V 100
12、 V、电流 40 mA下进行电泳 30 min 40 min。 2.4.4.7 结果判定 2.4.4.7.1.1 试验成立条件 当阴性对照 和空白对照 不出现条带、阳性对照出现 清晰条带 ，试验成立。 （参 照 附录 B 进行判定 ) 2.4.4.7.1.2 判定 若被检样品扩增出约 252 bp的片段，判定为鸡白痢阳性 。 3 防制措施 3.1 预防 3.1.1 消毒 3.1.1.1 制定生物安全制度，对进入鸡场的人员、物 品等进行严格消毒。 3.1.1.2 鸡舍、鸡笼、墙面、地面、运输工具等可 用 1 %的高效消毒剂、 0.1 %的 新洁尔灭、 2 %的 火 碱等药液定期 喷洒消毒。 3.
13、1.1.3 孵化 设施 在使用前 用 福尔马林 密闭熏蒸 消毒 。 3.1.2 药物预防 用敏感类药物对初生雏鸡（ 1 15日龄 ）进行药物预防。 3.1.3 鼠害防控 鼠类是沙门菌的主要携带者，对鸡场进行灭鼠，防止由鼠类传播沙门菌。 3.1.4 饲料防控 对购入的饲料进行隔离、检疫、消毒，合格的饲料方可进入鸡场。 3.2 检疫净化 3.2.1 蛋用种鸡场须在开产前，通过全血或血清平板凝集试验进行 2次检疫，相隔时间不得少于 21 天，检出并淘汰阳性鸡。 3.2.2 肉用种鸡 场须在 45日龄至开产之间，通过全血或血清平板凝集试验每月检疫 1次，相隔时间不 得少于 21天，检出并淘汰阳性鸡。
14、3.2.3 商品代饲养场户以预防为主，引入的鸡只应选自检疫鸡白痢沙门菌且为阴性的鸡场。 DB 15/T 99 2020 5 4 疫病控制 4.1 疫病控制方法 4.1.1 坚持自繁自养，需引进鸡只时提前检测鸡白痢沙门菌。 4.1.2 制定完善的生物安全制度，严格管控进入鸡场的人员、设备、车辆、物品等。 4.1.3 对进入鸡场的人员、设备、车辆、物品等进行彻底清理及消毒。 4.1.4 对出现全血或血清平板凝集试验阳性的鸡只及时淘汰，并对病鸡所在鸡笼、饲料槽、饮水槽等 进行彻底清理及消毒，同群鸡只隔离观察两周后 ，无异常情况的可在无污染区域进行饲养。 4.2 疫病控制要求 4.2.1 控制标准 连
15、续两年每个月抽检存栏数的 1 % 2 %，用全血或血清平板凝集试验检测，抽检阳性率在 0.5 %以 下即达到控制要求。 4.2.2 净化标准 达到控制标准后，每个月抽检全群，连续两年全血或血清平板凝集试验检测结果均为阴性即达到净 化标准。 DB 15/T 99 2020 6 附录 A （规范性附录） PCR反应溶液的配制 TAE 电泳缓冲液（ pH 约 8.5）的配制要求如下： 50 TAE 电泳缓冲储存液 三羟 甲基 氨基甲烷（ Tris碱 ） 242 g 乙二胺 四乙酸二钠（ Na2EDTA） 37.2 g 双蒸水 800 mL 待上述混合物完全溶解后，加入 57.1 mL的醋酸充分搅拌溶
16、解，加双蒸水至 1 L后，置室温保存。应 用前，用双蒸水将 50 TAE电泳缓冲液 50倍稀释。 DB 15/T 99 2020 7 附录 B （资料性附录） PCR检测鉴定结果 B.1 鸡沙门菌 PCR引物序列见表 B.1。 表 B.1 PCR引物序列 检测目的基因 speC上游引物 speC下游引物 speC基因 CGGTGTACTGCCCGCTAT CTGGGCATTGACGCAAA B.2 鸡沙门菌 PCR电泳图见图 B.2。 表 B.2 PCR电泳图 说明： M1 DL 2000 DNA Maker； 1 沙门菌； 2 阳性对照； 3 阴性对照； 4 100bp DNA Ladder。 _
