1、 -ICS 67.050 X 04 备案号： 内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准 DB15 DB15/T 4432008 乳及乳制品中黄曲霉毒素M1含量的测定 高效液相色谱法 Determination of Aflatoxin M1 in Milk and Milk Products-HPLC 2008-06-30发布 2008-08-01实施 内蒙古自治区质量技术监督局 发布 DB15/T 4432008 I 前 言 本标准的附录A为资料性附录。 本标准由内蒙古出入境检验检疫局提出。 本标准起草单位：内蒙古出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：潘国卿、张春艳、白国涛、刘来俊、张伟、李红
2、、敖威华、郭铁筝。 DB15/T 4432008 2 乳及乳制品中黄曲霉毒素M1含量的测定 高效液相色谱法 1 范围 本标准规定了乳及乳制品中黄曲霉毒素M1含量的高效液相色谱测定方法。 本标准适用于液态乳及乳粉中黄曲霉毒素M1含量的测定。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的 修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 原理 用石油醚去除样品中的脂
3、肪，三氯甲烷提取样品中的黄曲霉毒素M1，硅胶固相萃取柱净化，高效液 相色谱仪-荧光检测器测定，外标法定量。 4 试剂和材料 除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。 4.1 乙腈：色谱纯。 4.2 甲醇：色谱纯。 4.3 三氯甲烷：重蒸馏。 4.4 石油醚：重蒸馏。 4.5 二氯甲烷：重蒸馏。 4.6 氯化钠。 4.7 黄曲霉毒素 M1标准溶液：10 g/mL，5 以下避光保存，可使用 6个月。 4.8 黄曲霉毒素 M1标准工作溶液：100 ng/mL，将黄曲霉毒素 M1标准溶液用乙腈逐级稀释，5 以下 避光保存，可使用 1个月。 5 仪器和设备 5.1 高效液相色
4、谱仪：配荧光检测器。 5.2 氮吹仪。 5.3 离心机。 5.4 固相萃取装置。 5.5 往复振荡摇床。 5.6 高纯水发生器。 5.7 SPE硅胶柱：0.5 g，6 mL，使用前用3 mL正己烷、3 mL二氯甲烷进行预处理，保持柱体湿润。 6 分析步骤 6.1 提取 6.1.1 液态乳 DB15/T 4432008 3 准确称取液态乳样品 10 g（精确到 0.01 g），置于 50 mL 离心管中，加入 10 mL 甲醇及 1.0 g 氯 化钠，振荡 10 min，加入 25 mL 石油醚，振荡 10 min，以 4000 r/ min 离心 5 min，弃去上层液（石 油醚层），再加入3
5、0 mL 三氯甲烷，振荡10 min，以4000 r/ min离心 5 min，弃去上层液（甲醇层）， 将下层液吸至另一离心管，40 下氮气吹干，加 3 mL二氯甲烷溶解残余物，待净化。 6.1.2 乳粉 准确称取乳粉样品 12 g（精确到 0.01 g）,置于250 mL烧杯中，少量多次加入 50 mL 煮沸并冷却 至 60 左右的水溶解，冷却至室温后，移入 100 mL 容量瓶中，用少量水分次淋洗烧杯，淋洗液一并 移入容量瓶，再用水定容到刻度，混匀。准确量取该样品溶液 10.00 mL，以下操作同 6.1.1。 6.2 固相萃取柱净化 将上述待净化样品溶液以3 mL/min 的流速通过硅胶
6、固相萃取柱，用3 mL正己烷及3 mL二氯甲烷 淋洗萃取柱，弃去淋洗液。再用6 mL 氯仿丙酮（1+1）进行洗脱，收集洗脱液于10 mL离心管中，40 下氮气吹干，加1.00 mL乙腈溶解残余物，过0.45 m 滤膜，待测定。 6.3 测定 6.3.1 液相色谱条件 6.3.1.1 色谱柱：ZORBAX SB-C18柱，250 mm4.6 mm i.d10 m 或相当者。 6.3.1.2 流动相：A为水，B为乙腈，梯度洗脱。 时 间 A % B % 5.0 min 97 97 3 10.0 min 75 25 15.0 min 20 80 6.3.1.3 流速：1.0 mL/min 。 6.3
7、.1.4 柱温：20 。 6.3.1.5 测定波长：激发波长 360 nm ，发射波长 410 nm 。 6.3.1.6 进样量：25 L。 6.3.2 液相色谱测定 用流动相（水乙腈=973）以1.0 mL/min 流速平衡至基线平稳后，根据试样中被测物的含量， 选取响应值相近的标准工作液一起进行色谱分析，标准工作液和待测液中的黄曲霉毒素M1的响应值均应 在仪器的线性响应范围内，对标准工作液和待测液等体积进样测定，以保留时间定性，外标法定量。在 上述液相色谱条件下，黄曲霉毒素M1标准品的色谱图见附录A 。 6.3.3 空白试验 除不加试样外，均按照上述步骤进行。 7 结果计算 用色谱工作站软
8、件或按下式计算试样中黄曲霉毒素 M1的含量，计算结果需扣除空白值： mA FVcAX s 式中： X 试样中被测物含量，单位为微克每千克（g/kg）； A 试样溶液中被测物的色谱峰面积； c 工作溶液中被测物浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）； V 样液最终体积，单位为毫升（mL）； F 换算系数，液态乳F=1，乳粉F=10； DB15/T 4432008 4 As 标准工作溶液中被测物的色谱峰面积； m 称取的试样量，单位为克（g）。 8 测定低限 本方法的测定低限（以液态乳计）：0.050 g/kg 。 9 精密度 在重复条件下获得的两次独立测定结果的绝对值差值不得超过算术平均值的 15 % 。 DB15/T 4432008 5 附 录 A （资料性附录） 黄曲霉毒素M1标准品色谱图 min10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 LU 1.2 1.4 1.6 1.8 2 2.2 2.4 图A1 黄曲霉毒素M1标准品色谱图 15.41
