1、ICS 65.020.20 B 05 DB15 内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准 DB 15/T 1938 2020 沙地云杉组织培养技术规程 Technical Regulation for Tissue Culture of Picea mongolica 2020-07-30发布 2020-08-30实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发布 DB 15/T 1938 2020 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2020给出的规则起草。 本标准由内蒙古自治区林业和草原局提出并归口。 本标准起草单位：内蒙古农业大学、内蒙古蒙荣园林绿化工程有限责任公司。 本标准主要起草人：白玉娥、
2、韩彦龙、哈布尔、代金玲、包文泉、彭鹏、娜苏勒玛 、 苗慧琴。 DB 15/T 1938 2020 1 沙地云杉组织培养技术规程 1 范围 本标准规定了沙地云杉组织培养育苗的术语和定义、环境器具消毒灭菌、培养基、外植体、胚性愈 伤组织诱导、胚性愈伤增殖培养、体细胞胚胎分化培养、体胚干化萌发培养、炼苗、移植培养等 基本内 容及技术要求。 本标准适用于利用沙地云杉组织培养技术生产苗木。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 LY/T 1882 林木组织培养育
3、苗技术规程。 DB15/T 1588 元宝枫组织培养育苗技术规程。 3 术语和定 义 LY/T 1882和 DB15/T 1588界定的术语和定义适用于本文件。 4 环境器具消毒灭菌 4.1 洗涤室和接种室消毒 工作前和结束后，使用臭氧紫外灯照射 1 h。 4.2 培养室消毒灭菌 每天工作结束后使用臭氧紫外灯照射消毒 2 h。如有较严重的组培苗感染现象，应采用甲醛 (HCHO， 10 mL/m)和高锰酸钾 (KMnO4， 5 g/m)混合薰蒸消毒，在密闭条件下熏蒸消毒 20 min 30 min，消毒后 要打开门窗通风换气。 4.3 超净工作台消毒灭菌 接种前用臭氧紫外灯照射消毒不少于 30
4、min，并用 70 %酒精喷洒消毒台面；定期清洗超净工作台的 过滤膜。 4.4 器具灭菌 4.4.1 接种器具灭菌 在 一 个接种台班结束后 ， 使用器具流水冲洗后，用锡箔纸包好， 置于高 压 灭菌锅灭菌 。接种工具 使 用前 ， 用酒 精灯外 焰灼烧 20s以上 ，或用接种工具灭菌器 直接灭菌。 DB 15/T 1938 2020 2 4.4.2 培养容器消毒灭菌 使用后的培养容器，流水冲洗残留培养基，高压灭菌锅消毒后存放 。 5 培养基 5.1 基本培养基 胚性愈伤诱导、增殖和分化均采用 1/2 LM基本培养基，干化萌发培养采用 1/2 MS基本培养基。 5.2 母液和激素配制与保存 5.
5、2.1 母液和激素配制 培养基母液配制见 附录 A.1、 A.2。 激素均配制浓度为 1.0 mg/mL。 5.2.2 母液和激素保存 母液和激素配制后，贴标签，记录溶液名称、配置时间、配置者， 并 在 4 条件下保存。母液应于 3个月之内使用，母液无结晶、无异色才能使用。 5.3 基本培养基配制 5.3.1 琼脂融化 以配置 1 L培养基为例（下同），加蒸馏水 700 mL左右，再加入 5.5 g 6 g琼脂，加热搅拌使琼脂 融化。 5.3.2 糖溶解 琼脂融化后，加入 20 g蔗糖，搅拌使糖溶解。 5.3.3 加母液 糖溶解后，按照附录 A.1或附录 A.2的要求加入母液，搅拌均匀。 5.
6、3.4 培养基定容 搅拌均匀后，加蒸馏水定容至 1 L。 5.3.5 基本培养基 pH值调节 充分搅拌后，将基本培养基 pH值调节至 5.7 5.8。 5.3.6 基本培养基分装 使用 240 mL规格的培养瓶定量分装，胚性愈伤诱导、增殖、分化培养均每瓶分装 50 mL；干化萌发 培养使用 350 mL规格的培养瓶，每瓶分装 65 mL，分装时勿将培养基沾在培养瓶瓶口。 5.3.7 培养瓶封口 盖紧瓶盖，或用封口膜封口。 5.3.8 培养基灭菌 DB 15/T 1938 2020 3 用高温高压蒸汽灭菌锅进行灭菌，蒸气压力 102.9 kPa（ 1.05 kg/cm2），温度 121 条件下保
7、持 15 min 20 min即可。 5.3.9 培养基冷却 灭菌后的培养基放在无菌环境中冷却，待完全凝固后使用。 5.3.10 培养基贮存 灭菌后的培养基应标明编号、种类、配制日期，在 4 无菌条件下贮藏备用，贮存时间不应超过 1 个月。 6 外植体 6.1 球果采集与清洗 8月初，采集授粉第 10周的未成熟球果， 清洗表 面。 6.2 种子剥离与灭菌 球果中剥取未成熟种子置于清水中，取下沉的种子置于培养皿中，用 75 %酒精浸泡 30 s 40 s，无 菌水冲洗 3次，再以 2 %次氯酸钠浸泡灭菌 6 min，无菌水冲洗 3 5次，用灭菌滤纸吸附残留水分。 6.3 外植体制备 在超净工作台
8、上，从灭菌的未成熟种子剥取完整合子胚作为外植体备用。 7 胚性愈伤组织诱导 7.1 培养基 胚性愈伤组织诱导培养基 为 1/2 LM + 6-BA 1.2 mg/L + 2,4-D2.7 mg/L。 7.2 接 种 将外植体均匀接种于培养基上，每瓶可接种 10个，接种后将瓶口迅速于酒精灯火焰上 灼烧 2 s，拧 紧瓶盖，标明编号。 7.3 培养 将接种后的培养瓶摆放培养架上，在温度 25 1 条件下，暗培养 25 d 30 d。 8 胚性愈伤增殖培养 8.1 培养基 增殖培养基为 1/2 LM + 2,4-D 0.8-1.6 mg/L + 6-BA0.8 mg/L。 8.2 接种 DB 15/
9、T 1938 2020 4 在超净工作台上，将诱导产生的胚性愈伤组织接种于增殖培养基上，每瓶均匀接种 5个，接种后盖 紧瓶盖，标明编号。 8.3 培养 将接种后的培养瓶摆放在组培架上。在温度 25 1 条件下，暗培养 25 d 30 d。 9 体细胞胚胎分化培养 9.1 培养基 分化培养基为 1/2 LM + ABA 22.5 mg/L + PEG-4000 45 g/L。 9.2 接种 从增殖培养基上取胚性愈伤组织，接种在分化培养基上，每瓶均匀接种 5个。 9.3 培养 将接种后的培养瓶摆放在培养架上；在温度 25 1 条件下，暗培养 45 d 50 d。 10 体胚干化萌发培养 10.1
10、干化 在超净工作台上，培养皿中垫两层湿润滤纸（以不滴水为宜），将分化成熟的体胚置于滤纸上，培 养皿封口摆放在培养架上，暗培养 3 d后，在 1500 Lx光照条件下培养 7 d，至体胚子叶呈绿色、胚根呈 红色为止。 10.2 萌发 10.2.1 培养基 萌发培养基为 1/2 MS + 30 g/L蔗糖 +0.5 g/L酸水解酪蛋白 + 0.25 g/L谷氨酰胺 + 0.5 g/L活性炭 + 3 g/L琼脂。 10.2.2 接种 在超净工作台上，将干化后的体胚接种于萌发培养基上，每瓶接种 5个。 10.2.3 培养 将接种后的培养瓶摆放在培养架上，在温度 25 1 、光照强度 1500 Lx 2
11、000 Lx、光照时间 为 14 h/d条件下 ,光暗交替培养 15 d。 11 炼苗 11.1 瓶苗炼苗 体胚萌发培养后，选择正常的组培瓶苗，置于温度 25 2 、湿度 70 % 80 %、光照强度 1500 Lx 2000 Lx的温室苗床上，松 开瓶盖 1 d 2 d，然后半开瓶盖 1 d 2 d，最后揭去瓶盖 3 d 5 d。 DB 15/T 1938 2020 5 11.2 穴盘炼苗 11.2.1 基质 草炭蛭石珍珠岩 =3 2 1混合物作为基质。用多菌灵 800倍液浸湿基质，用塑料布覆盖灭菌 24 h 后使用。 11.2.2 穴盘 穴盘规格选用孔径 8 cm、深度 8 cm。灭菌后的
12、基质填充穴盘容器，喷淋清水保湿，待用。 11.2.3 瓶苗移栽 取出瓶苗，用常温清水洗去残留培养基，避免损伤根部，穴盘基质扎孔植入瓶苗，穴盘置于温室苗 床上，常温清水饱和喷淋 1次。温室使用前，用 12 %百菌清烟雾剂熏蒸 3 4次。 11.2.4 温湿度管理 移栽后，每天雾化喷水，保持环 境湿度 80 % 90 %、温度 20 25 。 7 d后，逐渐降低湿度至 70 % 80 %，炼苗 1个月。 11.2.5 病害防治 移栽后每隔 5 d 7 d喷施 800倍液多菌灵或 400倍 700倍代森锰锌或甲基托布津 700倍 1500倍等 杀菌剂 1次。 12 移植培养 12.1 移植 将穴盘中
13、的幼苗连同基质一起移栽到相同基质的直径 18 cm、深度 20 cm的容器中，置于温室苗床继 续培养。 12.2 培养 12.2.1 水肥管理 移栽后，先在遮阴且通风良好的条件下，每天喷水 1 2次，培养 4 d 5 d，之后保持基质湿润， 2 周后逐渐撤掉遮阴。每隔 20 d叶面施肥 1次。 12.2.2 病害预防 幼苗期，每隔 7 d 10 d喷洒杀菌剂 1次，连续喷洒 3 4次。 DB 15/T 1938 2020 6 A A 附 录 A （规范性附录） 培养基母液配制 表 A.1 LM 培养基母液配制 母液名称 编号 化试名称 mg/L 扩大倍数 扩大后称量 mg 母液定容体积 mL
14、配置培养基吸取量 mL/L 大量元素 A NH4NO3 1650 25 41250 1000 40 KNO3 1900 47500 CaCl2 2H2O 440 11000 MgSO4 7H2O 370 9250 KH2PO4 170 4250 铁盐 B FeSO4 7H2O 27.8 100 2780 1000 10 Na2EDTA 2H2O 37.3 3730 微量元素 C MnSO4 4H2O 22.3 100 2230 500 5 ZnSO4 7H2O 8.6 100 860 H3BO3 6.2 100 620 KI 0.83 100 83 Na2MoO4 2H2O 0.25 100
15、25 CuSO4 5H2O 0.025 100 2.5 CoCl2 6H2O 0.025 100 2.5 有机成分 D 甘氨酸 2 200 400 1000 5 盐酸硫胺素 B1 0.1 200 20 盐酸吡哆酸 B6 0.5 200 100 烟酸 0.5 200 100 E 肌醇 100 50 5000 500 10 DB 15/T 1938 2020 7 附 录 A（续） （规范性附录） 培养基母液配制 表 A.2 MS 培养基母液配制 母液名称 编号 化试名称 mg/L 扩大倍数 扩大后称量 mg 母液定容体积 mL 配置培养基吸取量 mL/L 大量元素 A NH4NO3 1650 25
16、 41250 1000 40 KNO3 1900 47500 CaCl2 2H2O 440 11000 MgSO4 7H2O 370 9250 KH2PO4 170 4250 铁盐 B FeSO4 7H2O 27.8 100 2780 1000 10 Na2EDTA 2H2O 37.3 3730 微量元素 C MnSO4 4H2O 22.3 100 2230 500 5 ZnSO4 7H2O 8.6 100 860 H3BO3 6.2 100 620 KI 0.83 100 83 Na2MoO4 2H2O 0.25 100 25 CuSO4 5H2O 0.025 100 2.5 CoCl2 6H2O 0.025 100 2.5 有机成分 D 甘氨酸 2 200 400 1000 5 盐酸硫胺素 B1 0.1 200 20 盐酸吡哆酸 B6 0.5 200 100 烟酸 0.5 200 100 E 肌醇 100 50 5000 500 10 _
