1、ICS 11.220 B 41 DB15 内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准 DB 15/T 27 2020 代替 DB15/T 27-1992 禽霍乱防制技术规程 Prevention Technical Specifications for Avian cholera 2020-07-30发布 2020-08-30实施 内蒙古自治区 市场监督管理局 发布 DB 15/T 27 2020 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准代替了 DB15/T 27-1992禽霍乱防制技术规程 ，与 DB15/T 27-1992相比，除编辑性修改外 主要技术变化如下
2、： 修改了诊断技术、防制措施和考核验收标准（见 3、 4、 5， 1992版的 2、 3、 4） 。 本标准由内蒙古自治区农牧厅归口。 本标准起草单位：内蒙古自治区动物疫病预防控制中心。 本标准主要起草人：申捷、马立峰、张伶俐、萨茹拉、郭宇、贾皓、云涛、戴晓光、苏胜杰、王永 杰、特木尔巴根、武娅楠、赵心力。 本标准的历次版本发布情况为： DB15/T 27 1992。 DB 15/T 27 2020 1 禽霍乱防制技术规程 1 范 围 本标准规定了禽霍乱的诊断技术、预防和控制措施。 本标 准适用于饲养、经营、运输、屠宰、加工禽只的单位和个人。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不
3、可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存和运输技术规范 3 诊断技术 3.1 流行特点 本病是由多杀性巴氏杆菌引起的鸡、火鸡、鸭、鹅等多种禽类的传染病，鸡、火鸡、鸭、鹅等 家禽以及其他鸟类均易感，所有日龄禽类均可感染发病，但性成熟的成年鸡群更易感。本病一年四 季均可发生。本病呈世界性分布，急性暴 发时，发病率和死亡率均很高 。 3.2 临 诊诊断 3.2.1 急性型症状 急性感染的禽群中禽只突然死亡，随后即出现感染禽只发热、厌食、沉郁、腹泻、羽毛粗乱、 呼吸困难，
4、临死前鸡冠、肉垂呈黑紫色，鹅发病后肉髯肿胀，有热痛感，直至衰竭，昏迷而死。本 病病程短约半天，长约 1 3 d。 3.2.2 慢性型症状 急性型耐过或由弱毒菌株感染的禽只可呈慢性型病程，其特征主要表现为精神沉郁，食欲下降， 伴有不同程度腹泻，冠髯水肿，关节肿胀发炎可致跛行，口鼻分泌物增多 。 3.3 病理变化 急性型的病变主要是全身出血，肝脏肿大，呈棕色或棕黄色，表面密布针尖大灰白色坏死点， 脾脏和肺脏均肿大，肺脏上可见出血点，心包增厚，心包液增多，肌胃出血，肠内容物含血液，有 出血性肠胃炎。慢性型主要是局部感染，在关节、趾垫、腱鞘、眼结膜、肉垂、气囊、中耳、骨髓、 脑膜等部位呈现纤维素性化脓
5、性渗出、坏死或不同程度的纤维化 。 3.4 实验室诊断 DB 15/T 27 2020 2 3.4.1 血清学诊断 3.4.1.1 琼脂扩散试验（该方法不适用于水禽） 3.4.1.1.1 配制琼脂板 取 pH 6.4的 0.01 mol/L PBS溶液 100 mL，放于三角瓶中，加入 0.8 g 1.0 g琼脂糖， 8 g氯化钠。 将三角瓶在水浴中煮沸使琼脂糖熔化，再加入 1 %硫柳汞 1 mL，冷却至 45 50时，将洁净干燥的直 径 90 mm的无菌平皿置于平面上，每个平皿加入 18 mL 20 mL琼脂糖溶液，加盖待凝固后，将平皿倒置 以防水分蒸发。放入普通冰箱中保存备用 (时间不超过
6、 2周 )。若购买成品琼脂板试剂盒，可按照说明书 要求进行配制 。 3.4.1.1.2 打孔和封底 可用直径 4mm 的打孔器在已凝固的琼脂板上打孔，然后小心将孔中的琼脂挑出，用酒精灯轻烤平皿 底部封闭孔的底部，以防侧漏 。 3.4.1.1.3 加样 将稀释的抗原（按照试剂配制要求进行稀释）悬液滴入到中间孔，标准阳性血清加入外周的 1、 4 孔中，标准阴性血清和待检血清按顺序分别加入外周 2、 3、 5、 6 孔中。每孔均以加满不溢出为度 。 3.4.1.1.4 感作 加样完毕后，静置 5 min-10 min 后倒置放入湿盒内， 37中静置，分别在 24 h 和 48 h 观察结果 。 3.
7、4.1.1.5 结果判定 3.4.1.1.5.1 将琼脂板置于日光灯或侧强光下观察，标准阳性血清与抗原孔之间出现一条清晰的白色 沉淀线，标准阴性血清与抗原孔之间不出沉淀线，则试验成立。 3.4.1.1.5.2 若被检血清孔与中心孔之间出现清晰沉淀线，并与阳性血清孔与中心孔之间沉淀线的末 端相吻合，则被检血清判为阳性；若被检血清孔与中心孔之间不出现沉淀线，但阳性血清孔与中心孔 之间的沉淀线一端在被检血清孔处向抗原孔方向弯曲，则此孔 的被检样品判为弱阳性，应重复试验， 如仍为弱阳性，则判为阳性；若被检血清孔与中心孔之间不出现沉淀线，标准阳性血清孔与抗原孔之 间的沉淀线指向被检血清孔，则被检血清判为
8、阴性；若被检血清孔与中心抗原孔之间沉淀线粗而混浊 和标准阳性血清孔与中心孔之间的沉淀线交叉并直伸，待检血清孔为非特异性反应，应重复试验，若 仍出现非特异性反应则判为阴性。判阳性者视为禽体内存在禽霍乱抗体。 3.4.2 病原学诊断 3.4.2.1 涂片、镜检 用镊子夹持病变组织肝或脾，然后以灭菌剪刀剪取小块，夹出后将其新鲜切面在载玻片上压印或涂 抹成薄层；若取血液，用灭菌剪刀剪开心 脏进行蘸取或剪取凝血块、用新鲜切面在载玻片上压印或涂抹 成薄层；若是已经培养纯化的细菌，从菌落挑取少量涂片。将制备好的涂片火焰固定后进行革兰氏和瑞 氏染色，镜检时多杀性巴氏杆菌为革兰氏阴性球杆菌或短杆菌，菌体大小为
9、(0.2 m 0.4 m) (0.6 m 2.5 m)，单个或成对存在，瑞氏染色呈两极着染 。 3.4.2.2 分离培养和鉴定 DB 15/T 27 2020 3 按照 NY/T 541的要求采集并保存样品；最急性和急性病例，可采集濒死或死亡禽只的肝脏、脾脏、 心脏和血液等；慢性病例，一般采集局部病灶组织；活禽，通过鼻孔挤出黏液或将棉拭子插入鼻腔 中采 样。对不新鲜或已被污染的样品，可采集骨髓样。将病料接种于 5 %鸡血清的葡萄糖淀粉琼脂、鲜血琼 脂培养基或 5 %鸡血清脑心浸出液琼脂培养基，在 35 37下培养，经 18 h 24 h后，菌落直径为 1 mm 3 mm ，呈散在的圆形凸起，露
10、滴样或水滴样 。 3.4.2.3 动物试验 细菌纯培养物计数稀释后，以 1000 CFU 细菌经皮下或腹腔内接种小鼠、兔或易感鸡，接种动物在 24 h 48 h内死亡，并可从肝脏、心血中分离到多杀性巴氏杆菌 。 3.4.2.4 多杀性巴氏杆菌 PCR检测方法 3.4.2.4.1 器材 生物安全柜、 PCR仪、电泳仪、凝胶成像仪、恒温 水浴锅、振荡器、离心机、高压灭菌锅、研钵 。 3.4.2.4.2 试剂 Taq酶、 DNA模板、 dNTPs水、无菌双蒸水、 DL2000DNA Marker、 TAE、 琼脂糖、 。 3.4.2.4.3 DNA模板的制备 3.4.2.4.3.1 组织样品制备 组
11、织样品的处理：取约 0.5 g 的待检组织样品于灭菌干燥的研钵中充分研磨，加 2 mL 灭菌生理盐 水混匀。反复冻融 3 次， 3000 r/min 离心 5 min，取上清液转入无菌的 1.5 mL 塑料离心管中并编号， 样本在 2 8条件下保存，应不超过 24 h。若需长期保存，应放在 -70以下冰箱，但应避免反复冻 融。 纯化培养的细菌样品处理：对分离鉴定和纯化培养的细菌液体培养样品，直接保存于无菌的 1.5 mL 塑料离心管中密封，编号、保存和送检 。 3.4.2.4.3.2 热裂解 法 采用热裂解法提取 DNA，用枪头挑取菌液或菌株培养物加入到含 100 L无菌双蒸水的离心管中，反
12、复吹打，沸水浴 10 min 后立即放入 -20 冰箱冷冻 5 min，然后放入高速离心机 12000 r/min 离心 1 min， 上清液即为 PCR扩增用 DNA 模板 。 3.4.2.4.3.3 试剂盒 法 采用试剂盒提取 DNA，取处理好的增菌培养物或组织样品，使用商品化的 DNA 提取试剂盒提取 DNA 做为模板 ， DNA 模板可置于 -20保存备用 。 3.4.2.4.4 PCR反应体系 PCR反应体系见表 1。 DB 15/T 27 2020 4 表 1 PCR反应体系（总体积为 20 L） 10 Taq buffer(含 Mg2+) 2.0 L dNTPs（ 2.5mmoL
13、/L） 1.5 L 引物 KMT I T7(10 mol/L) 1.0 L 引物 KMT I SP6(10 mol/L) 1.0 L 模板 DNA（样品） 1.0 L 无菌双蒸水 13.0L Taq DNA 聚合酶 0.5L PCR 反应管中依次加入上述成分，充 分混匀后，瞬时离心，确保所有反应成分混匀并集于管底 。 3.4.2.4.5 PCR对照 设立阳性对照和阴性对照，用 菌数达到 108 CFU/mL 以上的液体培养基繁殖的多杀性巴氏杆菌 C48-1 株制备的 DNA 作为阳性对照，用无菌双蒸水作为阴性对照。 3.4.2.4.6 PCR扩增程序 将反应管置于 PCR仪内进行反应。反应条件
14、如下： 95预变性 5 min； 94 30 s， 55 30 s， 72 60 s， 30个循环； 72延伸 10 min。若使用成品试剂盒，则可按照试剂盒说明书配制体系和设定反应条 件。 3.4.2.4.7 凝胶电 泳 用 TAE（配制方法见附录 A） 制备 1.5 %琼脂糖凝胶 ， 并在凝胶未冷却时加入溴化乙锭替代物，使其 最终浓度为 0.5 g/mL。 待凝胶冷却后，在 1 TAE缓冲液中进行电泳，将扩增产物和 Marker 分别加入 1.5 %琼脂糖凝胶孔中，每孔加 10 L， 80 V 100 V 电压电泳 30 min，在紫外灯或凝胶成像仪下观察 结果。 3.4.2.4.8 结果
15、判 定 3.4.2.4.8.1 试验成立的 条件 当阴性对照不出现条带，阳性对照 扩增出 DNA片段为 460 bp的清晰条带 ，试验成立。 （参照附录 B 进行判定 )。 3.4.2.4.8.2 结果判定 试验成立情况下，待检样品扩增出的 DNA 片段为 460 bp，可判定待检样品为阳 性，否则待检样品 判为阴性。 4 防制措施 4.1 总 则 贯彻“预防为主”方针，坚持自繁自养的原则，加强饲养管理，执行卫生消毒制度，提高禽群的机 体抵抗力。加强鸡群的饲养管理，平时应执行鸡场兽医卫生防疫措施，以栋舍为单位采取全进全出的饲 养制度，一般从未发生本病的鸡场不进行疫苗接种。 DB 15/T 27
16、 2020 5 4.2 消 毒 4.2.1 使用对禽巴氏杆菌有效的消毒药品，可选用多种不同类型的广谱高效消毒剂，如 0.2 %百毒 杀、 0.3 %威力灭、 0.5 %抗毒威或 0.5 %菌毒杀等，定期对禽舍、笼具、网架、用具、料槽、饲养场 地、周围环境和粪便等进行交替喷雾消毒。春夏季节每周 2 3 次，秋冬季节每周 1 2 次，有疫情时 适当增加消毒药液的浓度、温度和消毒的次数，可有效杀灭饲养环境中的病原微生物，净化饲养环 境。 4.2.2 若禽场内发生疫情，在给禽只用药同时，可以在前 2 d 进行消毒 1 次 d，以后的每 8 d 进行 1 次带禽消毒处理，一直坚持到最后 1 只病禽死亡或
17、者是康复之后的一周才能停止。水禽场如果出现禽 霍乱的禽只，除了要采取上述相应的防制措施，还要配合用药物消毒被病禽污染的水池等封闭储水区 域，通常应该在空闲 1 2 个月之后方可再次启用。 4.3 免疫 程序 4.3.1 日常养殖预防可对禽群定期使用禽霍乱疫苗进行免疫接种。免疫 程序如下： 弱毒疫苗一般在 6 8 周龄进行首免， 10 12 周龄进行再次免疫，常采用饮水途径接种。 灭活疫苗一般在 10 12 周龄首免，肌内注射， 16 18 周龄再加强免疫 1 次。 4.3.2 在疫区和受威胁区可用禽霍乱弱毒冻干菌苗或禽霍乱荚膜多糖菌苗进行紧急预防，严格按说明 书使用。 4.4 隔离 引进禽类应
18、来自非疫区，并持有检疫合格证，需参照动物检疫管理办法执行。引进的禽只，隔 离观察 30 d，确认健康后，方可混群饲养。各种不同的禽类不宜混合饲养，以防相互传播。 4.5 治疗 对禽场内感染症状较轻的病禽要采用药物加以防制。同群 家禽，可用青霉素、链霉素、磺胺嘧啶钠 或增效磺胺嘧啶钠给禽只肌肉注射，一般是注射 2 次 /d，连续注射 2 d，也可做药敏试验来选择用药。 同时还可配合阿莫西林原粉给患禽饮水，一直到病禽恢复食欲 2 d 再停止给药。给患禽采取药物治疗的 同时，还要给可疑禽群和受威胁的健康禽群进行免疫接种，接种禽霍乱弱毒菌苗应该在停药 5 d 后，方 可避免药物影响免疫效果。 5 疫
19、病控制 如果禽只饲养场出现感染禽霍乱严重的患禽，应该尽快进行扑杀，将全部病死禽尸和扑杀禽尸进行 无害化处理，在疫区和受威胁区可以定期进行预防接种。感染但症状较轻的病禽可用青 霉素、链霉素、 磺胺嘧啶钠或增效磺胺嘧啶钠等进行治疗。新引进禽只需按要求严格进行隔离，对禽场内要定期消毒。 全部养殖场户应尽量坚持自繁自养，建立培育和养殖一套经营流程，确保各环节的安全卫生。 DB 15/T 27 2020 6 A A 附 录 A （规范性附录） PCR反应溶液的配制 50TAE 电泳缓冲储存液 三羟 甲基 氨基甲烷（ Tris 碱 ） 乙二胺 四乙酸二钠（ Na2EDTA） 双蒸水 242 g 37.2
20、g 800 mL TAE 电泳缓冲液（ pH 约 8.5）的配制要求如下： 待上述混合物完全溶解后，加入 57.1 mL 的醋酸充分搅拌溶解，加双蒸水至 1 L 后，置室 温保存。应用前，用无菌双蒸水将 50TAE 电泳缓冲液 50 倍稀释。 DB 15/T 27 2020 7 B B 附 录 B （资料性附录） PCR检测鉴定结果 B.1 PCR引物序列见表 B.1。 表 B.1 PCR引物序列 基因 bp 上游引物 (5-3) 下游引物 (5-3) 多杀性巴氏杆菌 (460) ATCCGCTATTTACCCAGTGG GCTGTAAACGAACTCGCCAC B.2 PCR 检测结果见图 B. 1。 M 1 说明： M 一 2000 Marker； 1 多杀性巴氏杆菌 图 B.1 多杀性巴氏杆菌 PCR检测结果 _
