1、 - - ICS 67.050 X 04 备案号： 内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准 DB15 DB15/T 4422008 乳及乳制品中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素 残留量的测定 高效液相色谱法 Determination of Oxytetrcycline、Tetracycline、Chlorotetrecycline、Doxycycline Residues in Milk and Milk Products-HPLC 2008- 06-30发布 2008- 08- 01实施 内蒙古自治区质量技术监督局 发布 DB15/T 4422008 I 前 言 本标准的附录A为资料性附录
2、。 本标准由内蒙古出入境检验检疫局提出。 本标准起草单位：内蒙古出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：潘国卿、张春艳、白国涛、刘来俊、张伟、李红、敖威华、郭铁筝。 DB15/T 4422008 1 乳及乳制品中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素 残留量的测定 高效液相色谱法 1 范围 本标准规定了乳及乳制品中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留量的高效液相色谱测定方法。 本标准适用于牛乳及乳粉中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留量的测定。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的 修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标
3、准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 原理 用草酸甲醇溶液提取样品中的土霉素、四环素、金霉素、强力霉素，并加入乙二胺四乙酸二钠消除 样品中金属离子的干扰，高效液相色谱仪-二极管阵列检测器测定，外标法定量。 4 试剂和材料 除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为 GB/T6682 规定的一级水。 4.1 乙腈：色谱纯。 4.2 甲醇：色谱纯。 4.3 乙二胺四乙酸二钠（Na2H2Y22H2O）。 4.4 草酸 (H2C2O42H2O)。 4.5 0.01 m
4、ol/L草酸溶液：称取 1.26 g 草酸，用水溶解并定容至 1000 mL。 4.6 0.01 mol/L草酸甲醇溶液：称取1.26 g草酸，用甲醇溶解并定容至1000 mL。 4.7 兽药标准品：土霉素、四环素、金霉素、强力霉素，纯度均大于 95 %。 4.8 土霉素、四环素、金霉素、强力霉素标准溶液：准确称取一定量土霉素、四环素、金霉素、强力 霉素标准品，分别用甲醇配成0.1 mg/mL 的标准储备溶液，于-18 避光保存，可使用2 个月。 4.9 土霉素、四环素、金霉素、强力霉素混合标准储备溶液：分别吸取适量的土霉素、四环素、金霉 素、强力霉素标准储备溶液于50 mL容量瓶中，用流动相
5、(6.2.1.2)稀释定容至刻度，使得混合标准储备 溶液中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素的浓度分别为10 g/mL, 10 g/mL, 20 g/mL, 20 g/mL, 于-18避光保存，可使用1 个月。 4.10 土霉素、四环素、金霉素、强力霉素混合标准工作溶液：根据需要用流动相(6.2.1.2)逐级稀释 成适当浓度的混合标准工作溶液，于-18 避光保存，可使用3天。 5 仪器和设备 5.1 高效液相色谱仪：配二极管阵列检测器。 5.2 酸度计。 5.3 高纯水发生器。 5.4 旋涡混合器。 DB15/T 4422008 2 5.5 超声波清洗器。 5.6 离心机。 6 分析步骤 6.1
6、 提取 6.1.1 牛乳 准确称取牛乳样品 5 g（精确到0.01 g）,置于 50 mL离心管中，加入 5.00 mL 0.01 mol/L 草酸甲 醇溶液，0.1 g 乙二胺四乙酸二钠，旋涡混合3 min，超声振荡 3 min，以 10000 r/min 离心 10 min， 吸出全部上清液并量出样液最终体积。上清液过0.45 m 滤膜，供液相色谱测定。 6.1.2 乳粉 准确称取乳粉样品 12 g（精确到 0.01 g）,置于250 mL烧杯中，少量多次加入 50 mL 煮沸并冷却 到 60 左右的水溶解，冷却至室温后，移入 100 mL 容量瓶中，用少量水分次淋洗烧杯，淋洗液一并 移入
7、容量瓶，再用水定容到刻度，混匀。准确量取该样品溶液 5.00 mL，以操作下同6.1.1。 6.2 测定 6.2.1 液相色谱条件 6.2.1.1 色谱柱：ZORBAX SB-C18柱，250 mm4.6 mm i.d10 m 或相当者。 6.2.1.2 流动相：乙腈+甲醇+0.01 mol/L草酸溶液（22+8+70）。 6.2.1.3 流速：1.0 mL/min 。 6.2.1.4 柱温：30 。 6.2.1.5 检测波长：360 nm，带宽 20 nm，参比波长430 nm，带宽 50 nm 。 6.2.1.6 进样量：25 L。 6.2.2 液相色谱测定 用流动相(6.2.1.2)以
8、1.0 mL/min流速平衡至基线平稳后，根据试样中被测物的含量，选取响应值 相近的标准工作液一起进行色谱分析，标准工作液和待测液中的土霉素、四环素、金霉素、强力霉素的 响应值均应在仪器的线性响应范围内，对标准工作液和待测液等体积进样测定，以保留时间定性，外标 法定量。在上述液相色谱条件下，土霉素、四环素、金霉素、强力霉素标准品的色谱图见附录A。 6.2.3 空白试验 除不加试样外，均按照上述步骤进行。 7 结果计算 用色谱工作站软件或按下式计算试样中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留含量，计算结果需 扣除空白值： mA FVcAX si ii i 式中： Xi 试样中被测物含量，单位为毫克
9、每千克（mg/kg）； Ai 试样溶液中被测物的色谱峰面积； ci 工作溶液中被测物浓度，单位为微克每毫升（g/mL）； V 样液最终体积，单位为毫升（mL）； F 换算系数，牛乳 F=1，乳粉 F=20； Asi 标准工作溶液中被测物的色谱峰面积； m 称取的试样量，单位为克（g）。 DB15/T 4422008 3 8 测定低限 本方法的测定低限（以牛乳计）：土霉素、四环素为 0.050 mg/kg，金霉素、强力霉素为 0.10 mg/kg。 9 精密度 在重复条件下获得的两次独立测定结果的绝对值差值不得超过算术平均值的 10 % 。 DB15/T 4422008 4 附 录 A （资料性附录） 土霉素、四环素、金霉素、强力霉素标准品色谱图 min1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 mAU 0 0.5 1 1.5 2 2.5 图A.1 土霉素（OTC）、四环素（TC）、金霉素（CTC）、 强力霉素（DOXY）标准品色谱图 OT C 3.42 TC 3.90 CT C 6.85 DO XY 9.13
