1、ICS 65.020.30 B 44 DB15 内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准 DB15/T 1901 2020 绵羊日粮可代谢生脂物质（ MLS）指标的测 定技术规程 The technical specification for the determination of dietary metablizable lipogenous substances (MLS) in sheep 2020-06-10发布 2020-07-10实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发布 DB15/T 1901 2020 I 前 言 本标准按 GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由内蒙古
2、自治区农牧业科学院提出。 本标准由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（ SAM/TC 19）归口。 本标准起草单位：内蒙古自治区农牧业科学院。 本标准主要起草人：杜瑞平、卢德勋、高民、凌 树礼、马燕芬、胡红莲、王丽芳、羿静。 DB15/T 1901 2020 1 绵羊日粮可代谢生脂物质（ MLS）指标的测定技术规程 1 范围 本标准规定了绵羊 日粮可代谢生脂物质（ MLS）指标 的 定义和测定 方法。 本标准适用于绵羊日粮可代谢生脂物质（ MLS）指标 的 测定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用
3、文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 30431 实验室气相色谱仪 HJ 957 水质 钴的测定 火焰原子吸收分光光度法 3 术语和定义 下 列术语和定义适用于本文件。 3.1 挥发性脂肪酸 volatile fatty acids（ VFA） 日粮中的碳水化合物经瘤胃微生物发酵后产生的重要产物，以乙酸、丙酸、丁酸为主，是反刍动物 的主要能量来源及合成乳脂肪和体脂肪的前体物。 3.2 可代谢生脂物质 metabolizable lipogenous substances（ MLS） 饲料或日粮经动物消化吸收后，可以给动物本身提供的可利用的生脂物质（折合成乙酸总量）， 单
4、位为 g/d。 3.3 瘤胃 VFA基本产生速率 ruminal VFA production rate 瘤胃中每小时发酵生成的 VFA毫摩尔数（ mmol/h）。 3.4 瘤胃 VFA流通速率 ruminal VFA flow rate 瘤胃中每小时向后消化道流通的 VFA毫摩尔数（ mmol/h）。 DB15/T 1901 2020 2 3.5 瘤胃 VFA吸收速率 ruminal VFA absorption rate 每小时经瘤胃壁吸收的 VFA毫摩尔数（ mmol/h）。 3.6 瘤胃 VFA吸收率 ruminal VFA fractional absorption rate 每小时
5、经瘤胃壁吸收的 VFA数量占每小时产生量 的百分比（ %）。 4 仪器和试剂 4.1 仪器 电子分析天平（ 0.0001 g）， pH 酸度计，气相色谱仪，原子吸收仪，高速离心机 （ 10000 rpm/min） 。 4.2 试剂 乙酸、丙酸、丁酸、乙酸钴、乙二胺四乙酸、氢氧化钠、过氧化氢、乙醇等均为化学分析纯。 5 试验动物、日粮与饲养管理 5.1 试验动物 要求体况良好、年龄、体重相近的 6只以上安装有永久性瘤胃瘘管的任一成年绵羊品种。 5.2 日粮配制 试验日粮可对应相应生理阶段参照中国或 NRC绵羊饲养标准配制。 5.3 饲养管理 试验羊每隔 3 h给予等量混和日粮 ，每日饲喂 8次，
6、每期试验在预饲期和灌注期内均单笼饲养， 预饲 期 10 14天，预饲期内试验羊自由饮水，灌注期停止供水，用灌注液满足水的需要。 6 测定步骤 6.1 标记物的制备、投放与乙酸、丁酸的灌注 6.1.1 标记物的制备 Co-EDTA的制备根据 Uden等 (1980)介绍的方法进行。称取 25 g乙酸钴， 29.2 g乙二胺四乙酸和 4.0 g 氢氧化钠放入一个 2 L烧杯中，加入 200 mL蒸馏水，加热至 80 进行溶解，冷却后再加入 20 mL 30 % 过氧化氢溶液，室温放置 4 h后加入 300 mL95 %(V/V)乙醇溶液，置于冰箱 12 h，然后经定性滤纸过滤并 用 85 %(V/
7、V)乙醇溶液冲洗数遍。最后收集滤纸上粉红色物质于瓷盘中，置于 100 烘箱中烘干即可。 实测该 Co EDTA标记物 Co 含量为 14.08 %。 DB15/T 1901 2020 3 6.1.2 灌注前标记物的投放 连续饲喂 10 14天后，灌注期第一天晨饲前采集 20 mL瘤胃液后将 1 g Co EDTA溶于 50 mL蒸馏水中 经采样管通过瘤胃瘘管灌入绵羊瘤胃内不同位点，灌注完毕再抽取瘤胃液反复冲洗采样管 3次，并将冲 洗瘤胃液回灌瘤胃内。此后 2 h、 4 h、 6 h、 9 h、 12 h、 18 h和 24 h分别抽取瘤胃液 20 mL，用以测定 Co、 pH和 VFA。 6.
8、1.3 乙酸丁酸的启动灌注和连续灌注 6.1.3.1 启动灌注 上述 Co-EDTA投放后继续连续饲喂一周，第八天晨饲前开始启动灌注，将 100 mL启动灌注液通过注 射器经采样管迅速注入瘤胃内不同位点，灌注完毕用采样管充分搅匀瘤胃液，并抽取瘤胃液反复冲洗采 样管和注射器，冲洗瘤胃液及时回灌瘤胃内。 6.1.3.2 连续灌注 启动灌注结束后进行连续灌注。连续灌注 3 h后开始从瘤胃取样，瘤胃液每 2 h采一次，共采集 5次。 连续灌注结束后，紧接着灌注水 溶液，灌注速率不变，灌水中间每小时采瘤胃液一次，共采集 3次，采 样结束后让羊自由采食、饮水。 6.1.4 乙酸、丁酸的启动灌注液和连续灌注
9、液配制 启动灌注液和连续灌注液见附录 A的 表 A.1、表 A.2。 6.2 样品处理及分析方法 6.2.1 瘤胃液样品处理 采集的瘤胃液立即用四层纱布过滤，取 4 mL瘤胃液 ,加 1 mL25 %的偏磷酸固定，静置 30 min， 3000 rpm 下离心 10 min，直接上机测定 VFA和 Co或 -20 冰箱保存待测。 6.2.2 VFA测定 用气相色谱仪（ GB/T 30431）依内标法进 行测定，内标物为巴豆酸。 6.2.3 Co的测定 原子吸收法测定应符合 HJ 957的要求 。 6.2.4 瘤胃液 pH值 pH 酸度计直接测定。 7 计算公式 7.1 可代谢生脂物质（ MLS
10、）计算公式 可代谢生脂物质（ MLS）按式（ 1）计算： DB15/T 1901 2020 4 MLS=0.72*k1*Ac+1.8*k2*Bu +1.14*k3*Fat . （ 1） 式中： MLS 日粮可代谢生脂物质，单位为 g/d； 0.72 乙酸合成脂肪酸的效率； k1 瘤胃乙酸吸收率，单位为 %； Ac 瘤胃乙酸基本产生量，单位为 mmol/d， Ac等于瘤胃乙酸基本产生速率 (mmol/h)乘 24 h所得； 1.8 丁酸能值（ 2.194 MJ/mol）和乙酸能值（ 0.8763 MJ/mol）之比 2.50再乘以 0.72所得； k2 瘤胃丁酸吸收率，单位为 %； Bu 瘤胃丁
11、酸基本产生量，单位为 mmol/d， Bu等于瘤胃丁酸基本产生速率 (mmol/h)乘 24 h所得； 1.14 脂肪酸能值（ 1.000 MJ/mol）和乙酸能值之比； k3 过瘤胃脂肪的小肠吸收率，单位为 %； Fat 过瘤胃脂肪数量（以总脂肪酸数量表示 )，单位为 mmol/d。 注： 由于本标准验证试验采用的日粮为常规设计，不添加任何脂肪物质，因此所用日粮脂肪含量仅为 2 %左右，过 瘤胃脂肪极少，因此公式中的第三部分在常规日粮条件下可忽略不计，所得数值为瘤胃乙酸部分和丁酸部分提 供。如果日粮添加了脂肪，则需测定过瘤胃脂肪量，需取小肠液先进行水解，将残余脂肪先水解为脂肪酸，然 后再测定
12、总脂肪酸含量计算。 7.2 瘤胃乙酸、丁酸基本产生速率计算公式（以乙酸为例） 瘤胃乙酸基本产生速率按式（ 2）计算： P=I/(C V /CV-1) . （ 2） 式中： P 瘤胃 乙酸基本产生速率，单位为 mmol/h； I 乙酸连续灌注恒定速率， 60.00mmol/h； C 灌注后瘤胃乙酸浓度，单位为 mmol/L； V 灌注后瘤胃液相体积，单位为 L； C 灌注前瘤胃乙酸浓度，单位为 mmol/L； V 灌注前瘤胃液相体积，单位为 L。 7.3 连续灌注前后瘤胃液相体积计算公式 灌注前后的瘤胃液相体积按式 （ 3）、（ 4）计算： V 一次投放的 Co量 / Co(0) . （ 3）
13、V F /K . （ 4） 式中 ： V 灌注前瘤胃液相体积 ， 单位为 L； Co(0) 投放时间点瘤胃液相 Co浓度，单位为 mg/L； V 灌注后 瘤胃液相体积 ， 单位为 L； F 灌注后瘤胃液相流通速率， 单位为 L/h； K 灌注后瘤胃液相小时稀释速率， 单位为 /h。 7.4 灌注前后瘤胃液相小时稀释速率计算公式 灌注前后的瘤胃液相小时稀释速率按式（ 5）、（ 6）计算： Co(t) Co(0)*e-Kt . （ 5） Co(t) Co(0)*e-Kt . （ 6） DB15/T 1901 2020 5 式中 ： Co(t) t 时间点瘤胃液相 Co浓度，单位为 mg/L； Co
14、(0) 投放时间点瘤胃液相 Co浓度，单位为 mg/L； K 灌注前瘤胃液相小时稀释速率， 单位为 /h； K 灌注后瘤胃 液相小时稀释速率， 单位为 /h。 注： 一次性投 Co-EDTA后，各时间点测得的瘤胃液相 Co浓度的变化 作指数方程模拟 Co（ t） =Co（ 0） *e-Kt，可以得知 瘤胃液相小时稀释速率 K及投放时间点的 Co浓度。停止灌注乙酸、丁酸溶液改为灌注水后，试验羊瘤胃内 Co浓 度的变化作指数方程模拟 Co（ t） =Co（ 0） *e-Kt,可得瘤胃液相小时 稀释速率 K。 7.5 灌注前后瘤胃液相流通速率计算公式 灌注前后的瘤胃液相流通速率按式（ 7）、（ 8）
15、计算： F V*K . （ 7） F Co连续灌注速率 /连续灌注后瘤胃液相 Co浓 度 . （ 8） 式中： F 灌注前瘤胃液相流通速率， 单位为 L/h； V 灌注前瘤胃液相体积 ， 单位为 L； K 灌注前瘤胃液相小时稀释速率， 单位为 /h； F 灌注后瘤胃液相流通速率， 单位为 L/h； Co连续灌注速率 4.38 mmol/h。 7.6 灌注前后瘤胃乙酸流通速率计算公式 灌注前后的瘤胃乙酸流通速率按式（ 9）、（ 10）计算： AFR C*F . （ 9） AFR C*F . （ 10） 式中： AFR 灌注前瘤胃乙酸流通速率，单位为 mmol/h； C 灌注前瘤胃乙酸浓度，单位为
16、 mmol/L； F 灌注前瘤胃液相流通速率， 单位为 L/h； AFR 灌注后瘤胃乙酸流通速率，单位为 mmol/h； C 灌注后瘤胃乙酸浓度，单位为 mmol/L； F 灌注后瘤胃液相流通速率， 单位为 L/h。 7.7 灌注前后瘤胃乙酸吸收速率计算公式 灌注前后的瘤胃乙酸吸收速率按式（ 11）、（ 12）计算： AAR = P AFR . （ 11） AAR = P - AFR . （ 12） 式中： AAR 灌注前瘤胃乙酸吸收速率，单位为 mmol/h； P 瘤胃 乙酸基本产生速率，单位为 mmol/h； AFR 灌注前 瘤胃乙酸流通速率，单位为 mmol/h； AAR 灌注后瘤胃乙酸
17、吸收速率，单位为 mmol/h； P 灌注后瘤胃 乙酸产生速率，单位为 mmol/h； AFR 灌注后瘤胃乙酸流通速率，单位为 mmol/h。 DB15/T 1901 2020 6 注： 灌注后瘤胃乙酸产生速率 P等于瘤胃 乙酸基本产生速率 P加乙酸连续灌注恒定速率 I。 7.8 灌注前后瘤胃乙酸吸收率计算公式 灌注前后的瘤胃乙酸吸收率按式（ 13）、（ 14）计算： A AAR/P . （ 13） A AAR /P . （ 14） 式中： A 灌注前瘤胃乙酸吸收率，单位为 %； AAR 灌注 前瘤胃乙酸吸收速率，单位为 mmol/h； P 瘤胃 乙酸基本产生速率，单位为 mmol/h； A
18、灌注后瘤胃乙酸吸收率，单位为 %； AAR 灌注后瘤胃乙酸吸收速率，单位为 mmol/h； P 灌注后瘤胃 乙酸产生速率，单位为 mmol/h。 A DB15/T 1901 2020 7 A B 附 录 A （规范性附录） 乙酸、丁酸启动灌注液、连续灌注液配制 表 A.1 乙酸、丁酸启动灌注液配方 乙酸启动灌注液 数值 丁酸启动灌注液 数值 体积（ mL） 100 体积（ mL） 100 乙酸浓度（ mM） 955 丁 酸浓度（ mM） 320 加入乙酸量（ mL） 5.77 加入丁酸量（ mL） 2.82 Co浓度（ mg/L） 422.4 Co浓度（ mg/L） 422.4 加入 Co-E
19、DTA量（ g） 0.3 加入 Co-EDTA量（ g） 0.3 NaHCO3（ g/L） 78 NaHCO3（ g/L） 78 KHCO3（ g/L） 38 KHCO3（ g/L） 38 NaCl（ g/L） 7 NaCl（ g/L） 7 表 A.2 乙酸、丁酸连续灌注液中各项指标的计算 乙酸连续灌注液 数值 丁酸连续灌注液 数值 连续灌注速率（ mL/h） 125 连续灌注速率（ mL/h） 125 乙酸浓度（ mM） 480 丁酸浓度（ mM） 80 乙酸灌注速率（ mmol/h） 60 丁酸灌注速率（ mmol/h） 10 Co浓度（ mg/L） 35 Co浓度（ mg/L） 35 加
20、入 Co-EDTA量（ mg） 52.5 加入 Co-EDTA量（ mg） 52.5 加入乙酸量（ mL） 42 加入丁酸量（ mL） 10.33 自由饮水速率（ mL/h） 125 自由饮水速率（ mL/h） 125 Co连续灌注速率（ mg/h） 4.375 Co连续灌注速 率（ mg/h） 4.375 DB15/T 1901 2020 8 B C 附 录 B （规范性附录） VFA测定方法 取瘤胃液 10 mL 4000 rpm/min离心 15 min，取上清液 4 mL加入 25 %的偏磷酸与甲酸按 3： 1配制的混 合液 1 mL，静置 40 min后，取 1 mL混和液加入 2
21、g酸性吸附剂 (Na2SO4： 50 %H2SO4： 硅藻土 W/V 30： 1： 20)和 4 mL巴豆酸溶液 (31.25 mM，溶剂为 CHCl3)，摇匀、澄清后上机测定。色谱条件：色谱柱为内径 3 mm， 长 2 m不锈钢柱，担体为 10 %的 FFAP(聚乙醇 20 mL与 2-硝基对苯二甲基的反应物 )加 1 % H3PO4的 Chromosob W(AW)。柱温 150 ，汽化室温度为 230 。空气压力为 0.35 kg/cm2，流量为 140 mL/min；氢气压力为 1.2 kg/cm2，流量为 14 mL/min， N2(载气 )流量为 55 mL/min。进样量为 1 L。 _
