1、ICS 65.020.20 B 05 DB15 内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准 DB15/T 1939 2020 文冠果组织培养育苗技术规程 Technical Regulation for Tissue Culture of Xanthoceras sorbifolia 2020-07-30发布 2020-08-30实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发布 DB15/T 1939 2020 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2020给出的规则起草。 本标准由内蒙古 自治区林业和草原局 提出并归口。 本标准起草单位 ： 内蒙古自治区林业科学研究院。 本标准主要起草人： 张文军 、
2、 王美珍、黄卫丽、宁静。 DB15/T 1939 2020 1 文冠果组织培养育苗技术规程 1 范围 本 标准 规定了 文冠果 组织培养的术语和定义 、环境及器具灭菌、培养基配制、外植体及其灭菌、初 代培养、增殖继代培养、壮苗培养、生根培养、组培瓶苗炼苗移栽和大田培育等基本内容及技术要求 。 本 标准 适用于 文冠果 组织培养 育苗 。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 LY/T 1882 林木组织培养育苗技术规程 DB15/T 1588 元宝枫组织
3、培养育苗技术规程 3 术语和定义 LY/T 1882和 DB15/ 1588界定的以及 下列术语和定义适用于本 文件 。 3.1 嫩茎 Tender stem 由腋芽经过初代诱导萌发长出的幼嫩枝条。 3.2 壮苗 Strong seedling 组培过程中，嫩茎经再培养后形成的生长健壮、叶片舒展、叶色正常的微弱木质化枝条。 4 环境及器具 消毒灭菌 4.1 准备 室消毒 每天用 84消毒液 等喷洒地面和实验台面，保持室内清洁。 4.2 接种室消毒灭菌 接种前用紫外灯照射 30 min 40 min， 消毒期间及关闭紫外灯 20 min内，人员不得进入 。 4.3 培养室消毒 一个月左右进行 1
4、次，在使用前一天 用 二氧化氯消毒剂进行熏蒸 ，或用 70 %-75 %酒精擦拭培养架。 DB15/T 1939 2020 2 4.4 超净工作台灭菌 接种前应用紫外灯照射 30 min-40 min， 开启无菌风 40min后，操作前 用 70 %-75 %酒精喷洒台面； 定期清洗超净工作台的过滤膜 。 4.5 器具灭菌 4.5.1 接种工具灭菌 接种前 ， 将 接种工具 用滤纸包好， 置于 高温 高 压 灭菌锅灭菌 ； 使用前用酒精灯外 焰灼烧 20 s以上 ， 或用接种工具灭菌器 直接灭菌。 4.5.2 污染瓶 （皿） 灭菌 、清洗 将污 染 瓶 用高温高压 蒸汽 灭菌锅灭菌后，去除污染
5、物，再用洗洁精稀释液浸泡后清洗干净，晾干 。 4.6 操作人员入室要求 进入接种室前，经风淋门进入缓冲室，穿戴经过消毒的工作服、帽子、口罩等。在操作前，用 70 %-75% 酒精 擦拭手部、臂部。 5 培养基配制 5.1 基本 培养基 的选择 选择 WPM和 MS培养基为基本培养基。 5.2 母液的配制和保存 5.2.1 母液的配制 MS培养基由 几种化合物的混合母液 配制 。微量元素母液配制 1000倍， 铁盐和有机元素 母液 配制 100 倍，大量元素母液配制 40倍 ， 其中氯化钙和磷酸二氢钾单独配制成 100倍母液 ，植物生长 调节 物质配制 浓度 0.2 mg/mL。 MS培养基混合
6、母液配制表参见附录 A，植物生长调节物质的配制参见附录 B。 5.2.2 母液的保存 母液配制后， 贴 标签 ，置于 4 环境下保存， 并在 3个月 内使用 ，母液应 无结晶无异色 。标签需标 明母液名称、倍数、配制时间和配制人等信息。 5.3 基本 培养基 的配制 5.3.1 准备 配制前 准备好蒸馏水、蔗糖、琼脂和各类母液， 同时准备好移液枪、容量瓶、量筒、 量杯 、天平、 药匙 、 磁力搅拌器 和 pH计等 器 具 。 5.3.2 琼脂融化 以配制 1L培养基为例（下同）。 加蒸馏水 700 mL左右，再加入 5.8 g琼脂，加热搅拌使琼脂融化。 DB15/T 1939 2020 3 5
7、.3.3 糖溶解 琼脂融化 后，加入 30 g蔗糖，搅拌使糖溶解。 5.3.4 加母液 和激素 糖溶解后， 加入 母液，再根据 不同培养基 要求加入 耐高温 激素 ， 充分搅拌 。 不耐高温的激素，如 GA3、 IBA、 IAA、 ABA等 应在培养基高温高压灭菌后加入，加入前需过滤灭菌。 5.3.5 定容 搅拌均匀后，加蒸馏水定容至 1 L。 5.3.6 pH 值测定 和调节 充分搅拌后， 用 pH计测定 pH值， 用 1 mol/L的 HCl或 1 mol/L 的 NaOH调节至 pH 5.8 6.0。 5.3.7 分装 使用培养瓶 定量分装 ，瓶中培养基厚度保持在 1.5 cm 2.0
8、cm。分装培养基时勿将培养基沾在培养 瓶瓶口。分 装后 标注培养基种类代码。 5.3.8 封口 盖 紧 瓶盖，或用封口膜封口。 5.3.9 灭菌 应用高温高压蒸汽灭菌锅进行 灭菌 ，通常在压力 1.1 kg/cm2、温度 121 条件下保持 20 min 30 min 即可。 5.3.10 冷却 灭菌后的培养基 置于无菌接种室 冷却，待完全凝固后使用。 5.3.11 贮存 灭菌后的培养基应 标注 配制日期。 在无菌室温条件下贮存备用， 贮存时间不应超过一个月。 6 外植体及 其灭菌 6.1 外植体 采集 6-8月份，晴天 10点至 16点之间，选取生长健壮、腋芽饱满、无病虫害的半木质化枝条。
9、6.2 外植体的灭菌 将采集 的 枝条剪掉 叶片， 置于容器 内 用洗洁精饱和液 浸泡 10 min，用软刷刷洗后 ，剪成 长度 8 10 cm 的枝 段 ，放入容器内，用 1层 纱布 等网状物 包裹 容器口， 用流水冲洗 60 min 90 min后 ， 置于 超净工作 台上灭菌 ：用 70 %酒精浸泡 30 s，无菌水冲洗 3次，再用 0.1 %氯化汞溶液 浸泡 5 min，用无菌水冲洗 5 8次，用 灭菌滤纸吸附残留水分后接种 。 DB15/T 1939 2020 4 6.3 外植体 切 段 在超净 工作台内，用灭菌后的剪刀和镊子 将枝段均匀切分成长度 2 cm左右 的 外植体小段，每小
10、 段 上 部至少保留 1个腋 芽 。 7 初代培养 7.1 初代培养基 初代培养为 WPM + 6-BA 1.0 mg/L +NAA 0.1mg/L+TDZ 0.05 mg/L+水解乳蛋白 0.25 g/L+肌醇 0.2 g/L。 7.2 外植体的接种 在超净工作台上，将外植体小段接种到初代培养基上，每瓶培养瓶接种 1个外植体小段。小 段 下半 部斜 插入培养基内， 封紧瓶口，标明接种日期。 7.3 培养方法 将接种后的培养瓶 送到培养室，整齐摆放在组培架上 ，诱导腋芽萌发，培养 15 d-20 d。培养室温 度控制在 25 2 ， 相对湿度 保持在 40 60 ， 光照强度控制在 1500
11、lx 3000 lx， 光照时间 13 h/d。 8 增殖继代培养 8.1 继代 培养基 增值继代培养 基为 MS+6-BA 0.3 mg/L+IBA 0.8 mg/L+GA3 1.0 mg/L+AC 0.1 mg/L+Ca(NO3)2 1.0 g/L+ 琼脂 6.0 g/L+蔗糖 30.0 g/L。 8.2 培养方法 经初代培养，腋芽萌发的嫩茎生 长到 3 cm 5 cm 时 进行 继代培养 。 在超净工作台上，将初代培养的嫩茎切成 2 cm左右 且上部至少带有 1个 芽 的茎段；每瓶培养基接种 1 个茎段，将 茎段 下半段 插入培养基内， 封紧瓶口，标注转接日期。 将转接后的培养瓶 送到培
12、养室，整齐摆放在组培架上 ， 20 d 30 d继代 1次 。 培养条件 同 7.3。 9 壮苗培养 9.1 壮苗培养基 壮苗培养基为 MS+6-BA 0.1 mg/L +IBA 0.3 mg/L+AC 0.1 mg/L。 9.2 培养方法 将继代增殖中生长瘦弱、长度不足 2 cm的嫩茎整体转接到壮苗培养基中进行壮苗培养。 培养 20 d 30 d。培养条件 同 7.3。 DB15/T 1939 2020 5 10 生根培养 10.1 生根 培养基 生根培养基为 1/2MS + IBA 0.5 mg/L。 10.2 培养方法 当继代增殖培养或经过壮苗培养的嫩茎生长到 2.0 cm 5.0 cm
13、时， 剪取 壮苗 接种在生根培养基上进 行生根培养 ，每个培养瓶接种 1个壮苗。壮 苗 在 培养基中的插入 深度为 5 mm 8mm，保持 壮 苗 直 立。 培养 20 d 45 d可 生根。 培养条件 同 7.3。 11 组培 瓶 苗 温室 炼苗移栽 11.1 炼苗 当 组培瓶苗 达到 2 3条 长度 1 cm以上 白色嫩根 、 3 5片正常绿叶、苗高 5 cm 6 cm时，将其 置于温 度 25 2 、湿度 80 % 90 %、 光照强度 1500 lx 2000 lx条件下的 温室苗床上 ， 锻炼 3 d后， 去掉 封口膜，再置于温室内小拱棚中 ， 继续锻炼 4 d。 11.2 移植 1
14、1.2.1 基质 处理 采用 体积比 为 松针土：珍珠岩：田园土为 1:1:1混合 物为基质。 基质混合过程中均匀喷入多 菌灵 800 倍液 。 11.2.2 移栽 用 镊子取出 组培瓶苗 ， 在流动水下 洗去 残留 培养基 ， 避免 损伤 苗根 ；在口径 9 cm、深 12 cm的营养 钵内填装适量基质，将清洗后 的 组培瓶 苗移 栽 到 营养钵 中 ，过程中避免伤根。移栽后置于小拱棚内。 11.2.3 移栽后管理 采用 细喷雾喷水 、 遮阴网 调节小拱棚内温 湿度 ，保持 湿度 80 90 、昼 温 21 29 、 夜温 18 21 、基质湿润， 1周后， 逐渐降低湿度。 11.2.4 有
15、害生物防治 移栽 前对温室用百菌清烟雾剂熏蒸 1次。 移栽后 每隔 7 d喷施 1次多菌灵。 12 大田育苗 12.1 容器苗炼苗 生长季节，将容器苗从温室移至大田炼 苗。将容器苗整齐紧密摆放 在 苗圃背 风 处， 先用 80 %透光率 的 遮阴网遮盖 炼 苗 1周 ， 然后在自然条件下 炼 苗 1周。 12.2 大田培育 DB15/T 1939 2020 6 12.2.1 整地 育苗地于前一年秋季深翻，并施入适量腐熟有机肥。 12.2.2 栽植 按株距 30 cm 40cm、行距 50 cm挖穴，移栽时去掉营养钵带土移栽，移栽后要及时灌溉，一周后浇 第二水灌溉。适时做好除草、松土、追肥、灌水
16、等田间管理工作。 DB15/T 1939 2020 7 A A 附 录 A （资料性附录） MS培养基混合母液配制 表 A.1 MS培养基混合母液配制表 母液名称 编号 化试名称 mg/L 扩大倍数 扩大后称 mg 母液定容体积 mL 配置培养基 吸取量 mL/L 大量元素 A NH4NO3 1650 40 66000 1000 25 KNO3 1900 40 76000 MgSO4 7H2O 370 40 14800 B CaCl2 2H2O 440 100 44000 1000 10 C KH2PO4 170 100 17000 1000 10 铁盐 D FeSO4 7H2O 27.8 1
17、00 2780 1000 10 Na2EDTA 2H2O 37.2 100 3720 微量元素 E MnSO4 4H2O 22.3 100 2230 1000 10 ZnSO4 7H2O 8.6 100 860 H3BO3 6.2 100 620 F KI 0.83 100 83 1000 10 Na2MoO4 2H2O 0.25 100 25 CuSO4 5H2O 0.025 100 2.5 CoCl2 6H2O 0.025 100 2.5 有机成分 G 甘氨酸 2 100 200 1000 1 盐酸硫胺素 B1 0.1 100 10 盐酸吡哆酸 B6 0.5 100 50 烟酸 0.5 1
18、00 50 H 肌醇 100 100 5000 500 10 DB15/T 1939 2020 8 B B 附 录 B （资料性附录） 常见植物生长调节物质母液配制 表 B.1 常见植物生长调节物质母液配制表 类别 种类 配置方法 常用浓度 mg/L 细胞分裂素 6-BA 先加少量水 ， 然后滴加少量 0.1mol/L 的盐酸 (HCl) 溶解， 然后加蒸馏水定容。 0.1-0.2 KT 0.05-2.0 ZT 0.05-2.0 TDZ 0.01-0.05 生长素 IAA 先用少量 无水乙醇 溶解，然后加蒸馏水定容。 0.1-1.0 IBA 0.05-1.0 NAA 0.01-0.5 2， 4-D 0.01-2.0 赤霉素 GA3 先用少量 无水乙醇 溶解，然后加水定容 。 0.01-0.5 _
