1、ICS 65.020.20 B 05 DB15 内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准 DB15/T 1940 2020 西部沙樱组织培养技术规程 Technical Regulation for Tissue Culture of Prunus pumila 2020-07-30发布 2020-08-30实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发布 DB15/T 1940 2020 I 前 言 本标准按照 GB/T1.1-2020给出的规则起草。 本标准由内蒙古自治区林业和草原局提出并归口。 本标准起草单位：内蒙古农业大学 、 内蒙古林业科学研究院。 本标准主要起草人： 白玉娥、托亚、哈布尔、彭鹏
2、、莎仁图雅、杨荣、宁静。 DB15/T 1940 2020 1 西部沙樱组织培养技术规程 1 范围 本 标准 规定了 西部沙樱 组织培养 育苗 的术语和定义 、环境道具消毒灭菌、培养基、外植体、初代培 养、增殖继代培养、生根培养、组培苗炼苗移栽等基本内容及技术要求 。 本 标准 适用于 利用西部沙樱 组织培养技术生产 苗木 。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 LY/T 1882 林木组织培养育苗技术规程 DB15/T 1588 元宝枫组织培养育苗技
3、术规程 3 术语和定义 LY/T 1882 和 DB15/T 1588界定的 术语和定义适用于本 文件 。 4 环境器具消毒灭菌 4.1 洗涤室和接种室消毒 工作前或结束后，使用臭氧紫外灯照射 1 h。 4.2 培养室消毒灭菌 每 10 d使用臭氧紫外灯照射消毒 2 h。如组培苗出现感染现象，应采用甲醛 (HCHO， 10 mL/m)和高 锰酸钾 (KMnO4， 5 g/m)混合薰蒸消毒，在密闭条件下熏蒸消毒 20 min 30 min，消毒后要打开门窗通 风换气。 4.3 超净工作台消毒灭菌 接种前用臭氧紫外灯照射消毒至少 30 min，并用 70 % 75 %酒精喷洒消毒台面；定期清洗超净
4、工作 台的过滤膜。 4.4 器具灭菌 4.4.1 接种器具灭菌 在 1个接种台班结束后，使用器具流水冲洗，用锡箔纸包好，置于高压灭菌锅灭菌。接种工具使用 前，用酒精灯外焰灼烧 20 s以上，或用接种工具灭菌器直接灭菌。 DB15/T 1940 2020 2 4.4.2 培养容器消毒灭菌 有污染的培养容器用高压灭菌锅消毒后，去除培养基，用流水冲洗残留培养基存放。 5 培养基 5.1 基本培养基 初代培养、增殖继代培养采用 MS基本培养基，生根培养采用 1/2 MS基本培养基。 5.2 母液和 激素配制与保存 5.2.1 配制 培养基母液配制见附录 A。激素均配制浓度为 1.0 mg/mL。 5.
5、2.2 保存 母液 和激素 配制后， 贴 标签， 记录溶液名称、配置时间、配置者， 并 在 4 条件下保存。母液应于 3个月之内使用，母液无结晶、无异色才能使用。 5.3 基本培养基配制 5.3.1 琼脂融化 以配置 1 L培养基为例 (下同 ） ,加蒸馏水 700 mL，再加入 5.5 g 6 g琼脂，加热搅拌使琼脂融化。 5.3.2 糖溶解 琼脂融化后，加入 30 g蔗糖，搅拌使糖溶解。 5.3.3 加母液 糖溶解后，按照附录 A的要求加母液，搅拌均匀。 5.3.4 培养基定容 搅拌均匀后，加蒸馏水 定容至 1 L。 5.3.5 基本培养基 pH值调节 充分搅拌后， 将基本培养基 pH值调
6、节 至 5.95 6.0。 5.3.6 基本培养基分装 愈伤诱导、增殖、分化培养使用 240 mL规格的培养瓶 定量分装 ，每瓶分装 50 mL；生根培养使用 350 mL规格的培养瓶，每瓶分装 65 mL， 分装时勿将培养基沾在培养瓶瓶口。 5.3.7 培养瓶封口 盖 紧 瓶盖，或用封口膜封口。 DB15/T 1940 2020 3 5.3.8 培养基灭菌 用高温高压蒸汽灭菌锅进行 灭菌 ， 蒸气压力 102.9 kPa（ 1.05 kg/cm2）， 温度 121 条件下保持 15 min 20 min即可。 5.3.9 培养基冷却 灭菌后的培养基 放在无菌环境中 冷却， 待完全凝固后使用。
7、 5.3.10 培养基贮存 灭菌后的培养基应 标明 编号 、种类、配制日期，在 4 无菌条件下贮藏备用， 贮存时间不应超过一 个月。 6 外植体 6.1 枝条采集 7月 9月份 ， 选择 晴天 9:00 11:00或 15:00 18:00之间， 采集 无病虫害、生长健壮的 带休眠芽 枝 条 备 用 。 6.2 外植体灭菌 6.2.1 表面清洗 将 采集的枝条 用洗洁精水刷洗表面，用流水冲洗 30 min后，剪成带 1 2个芽的 茎 段置于 容器 中 备用 。 6.2.2 茎段 灭菌 洗涤 后 的茎段 置于烧杯中，在超净工作台上 用 70 % 75 %酒精浸泡 30 s，无菌水冲洗 3 4次，
8、再用 0.1 %升汞浸泡 15 min， 之后 用无菌水冲洗 至少 5次， 再 用灭菌滤纸吸附残留水分。 6.3 外植体制备 在超净工作台 上 ，从灭菌的茎段 上 剥取休眠芽中 3 mm 5 mm的茎尖作为外植体备用。 7 初代培养 7.1 培养基 初代培养基为 MS + NAA 0.2 mg/L + 6-BA 0.5 mg/L + GA3 0.5 mg/L。 7.2 接种 将外植体均匀接种于培养基上，每瓶接种 3 5个，茎尖基部插入培养基 1 mm，露出芽，拧紧瓶盖， 标明编号。 7.3 培养 将接种后的培养瓶摆放 在 培养架上，在 温度 23 2 、光 照强度 2000 Lx 3000 L
9、x、 光照时间 12 h/d 14 h/d， 光暗交替 培养 20 d。 DB15/T 1940 2020 4 8 继代增殖培养 8.1 培养基制备 继代增殖培养基为 MS + 6-BA 1.0 mg/L + NAA 0.3 mg/L + GA3 0.5 mg/L。 8.2 接种 在超净工作台 上 ，将初代培养的幼苗切成带 1 2个腋芽的小段接种于继代增殖培养基上，每瓶均匀 接种 3个，茎段下部插入培养基内 1 mm，露出芽，接 种后将瓶口迅速 在 酒精灯火焰上灼烧 2 s，盖紧瓶盖， 标明编号。 8.3 培养 将接种后的培养瓶摆放培养架上， 在温度 23 2 、 光 照强度 2000 Lx
10、3000 Lx、 光照时间 12 h/d 14 h/d， 光暗交替 培养 30 d 50 d。 9 生根培养 9.1 培养基 生根培养基为 1/2 MS + NAA 0.2 mg/L + IBA 0.8 mg/L。 9.2 接种 继代增殖培养 的 不定芽 高度达到 20 mm 30 mm 时， 齐培养基面 剪取生长健壮、叶片舒展、叶色正 常 的 不定芽 ， 接种在生根培养基上， 接种 深度为 3 mm 5 mm， 每瓶均匀接种 8 10株。接种后将瓶口迅 速 在 酒精灯火焰上灼烧 2 s，盖紧瓶盖，标明编号。 9.3 培养 将接种后的培养瓶摆放在培养架上， 在温度 23 2 、 光照强度 20
11、00 Lx 3000 Lx、 光照时间 为 12 h/d 14 h/d， 光暗交替 培养 10 d。 10 炼苗 10.1 瓶苗炼苗 选择 带有 3 5片正常绿叶、苗高 50 mm 60 mm的组培苗，置于温度 25 2 、 湿度 80 %以上 、 光照强度 1500 Lx 2000 Lx的温室苗床上，松开瓶盖 1 d 2 d，然后半开瓶盖 1 d 2 d，最后揭去瓶盖 3 d 5 d。温室使用前，用 12%百菌清烟雾剂熏蒸 3 4次。 10.2 穴盘炼苗 10.2.1 基质 草炭 蛭石 珍珠岩 =3 2 1混合作 为基质。 用多 菌灵 800倍液浸湿 基质，用塑料 布 覆盖灭菌 24 h 后
12、使用。 DB15/T 1940 2020 5 10.2.2 穴盘 穴盘规格选用孔径 8 cm、深度 8 cm。灭菌后的基质填充穴盘容器 ， 喷淋清水保湿 ， 待用。 10.2.3 瓶苗移栽 取出瓶苗，用常温清水洗去残留培养基，穴盘基质扎孔植入瓶苗，置于温室苗床上，常温清水饱和 喷淋 1次。 10.2.4 温湿度管理 移栽后，每天雾化喷 水，保持环境湿度 80 90 、温度 20 25 。 1周以后，湿度逐渐降 低到 70 %， 炼苗 1个月。 10.2.5 病害防治 移栽后每隔 5 d 7 d喷施 800倍液多菌灵 ， 或 400倍 700倍代森锰锌 ， 或甲基托布津 700倍 1500 倍杀
13、菌剂一次。 11 温室 移植培养 11.1 移植 将穴盘中的幼苗连同基质一起移栽到直径 18 cm、深度 20 cm的相同基质容器中，置于温室苗床 上 继 续培养。 11.2 培养 11.2.1 育苗环境 温度 20 22 ， 湿度 70 % 80 %， 自然光照 ， 通风良好。 11.2.2 水肥管理 移栽后，每天喷水 1 2次，培养 4 d 5 d， 每隔 20 d叶面施肥 1次。 11.2.3 病害预防 幼苗期，每隔 7 d 10 d喷洒杀菌剂 1次，连续喷洒 3 4次。 DB15/T 1940 2020 6 A A 附 录 A （规范性附录） MS 培养基母液配制 表 A.1 MS 培
14、养基母液配制表 母液名称 编号 化试名称 mg/L 扩大倍数 扩大后称量 mg 母液定容体积 mL 配置培养基吸取量 mL/L 大量元素 A NH4NO3 1650 25 41250 1000 40 KNO3 1900 47500 CaCl2 2H2O 440 11000 MgSO4 7H2O 370 9250 KH2PO4 170 4250 铁盐 B FeSO4 7H2O 27.8 100 2780 1000 10 Na2EDTA 2H2O 37.3 3730 微量元素 C MnSO4 4H2O 22.3 100 2230 500 5 ZnSO4 7H2O 8.6 100 860 H3BO3 6.2 100 620 KI 0.83 100 83 Na2MoO4 2H2O 0.25 100 25 CuSO4 5H2O 0.025 100 2.5 CoCl2 6H2O 0.025 100 2.5 有机成分 D 甘氨酸 2 200 400 1000 5 盐酸硫胺素 B1 0.1 200 20 盐酸吡哆酸 B6 0.5 200 100 烟酸 0.5 200 100 E 肌醇 100 50 5000 500 10 _
