1、 ICS 07.100.99 B 41 DB15 内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准 DB15/T 1849 2020 动物垫料中大肠菌群检测 Detection for coliforms in animal bedding 2020-02-25 发布 2020-03-25 实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发布 DB 15/T 1849 2020 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国呼和浩特海关提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国呼和浩特海关、鄂尔多斯市动物 疫病预防控制中心、内蒙古自治 区农牧业科学院。 本标准主要起草人：
2、赵治国、延涵、崔强、王海艳、于志超、陈林军、敖威华、张晓东、盛万里、 罗晓平、李军燕。 DB 15/T 1849 2020 1 动物垫料中大肠菌群检测 1 范围 本标准规定了动物垫料中大肠菌群 MPN计数法和平板计数法。 本标准适用于动物垫料中大肠菌群的定量检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方 法 GB/T 8170 数值修约规则与极限数值的表示和判定 SN/T 1538.1 培养基制备指南第 1
3、部分：实验室培养基制备质量保证通则 SN/T 1538.2 培养基制备指南第 2部分：培养基性能测试实用指南 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 动物垫料 animal bedding 用于吸收动物排泄物，使动物保持舒适生活环境的铺垫物。也包括动物笼内非直接与动物机体接触 的铺垫物。 3.2 大肠菌群 coliforms 培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧的一群革兰氏阴性无芽胞杆菌。 3.3 最可能数 most probable number(MPN) 泊松分布的一种间接计数方法。 3.4 菌落形成单位 colony forming unit（ CFU） 在琼脂平
4、板上经过一定温度和时间培养后形成的每一个菌落，是计算细菌或霉菌数目的单位。 DB15/T 1849 2020 2 4 检验原理 4.1 MPN 计数法 MPN计数法是统计学和微生物学相结合的一种定量检测法。待测样品经系列稀释并培养后，根据其 未生长的最低稀释度与生长的最高稀释度，应用统计学概率论推算出待测样品中大肠菌群的最大可能数。 4.2 平板计数法 大肠菌群在固体培养基中发酵乳糖产酸，在指示剂的 作用下形成可计数的红色或紫色，带有或不带 有沉淀环的菌落。 5 仪器和设备 5.1 恒温培养箱： 36 1 。 5.2 冰箱： 2 5 。 5.3 恒温水浴 箱： 46 1 。 5.4 天平：感量
5、 0.1 g， 0.0001 g。 5.5 均质器。 5.6 漩涡 混合器 。 5.7 高压灭菌器。 5.8 菌落计数器。 5.9 无菌试管： 18 mm 180 mm。 5.10 无菌吸管： 1 mL(具 0.01 mL 刻度 )、 10 mL(具 0.1 mL 刻度 )或微量移液器及吸头。 5.11 无菌滤膜均质袋 。 5.12 无菌锥形瓶： 500 mL。 5.13 无菌量筒。 5.14 无菌规格板： 5 cm 5 cm。 5.15 无菌培养皿： 15 mm 90 mm。 5.16 无菌棉签。 5.17 无菌镊子。 5.18 无菌剪刀。 5.19 无菌勺。 5.20 pH计或 pH比色管
6、或精密 pH 试纸。 6 培养基和试剂 6.1 实验用水：符合 GB/T 6682 的要求。 6.2 月桂基硫酸盐胰蛋白胨 (lauryl sulfate tryptose， LST)肉汤：见附录 A.2。 6.3 煌绿乳糖胆盐 (brilliant green lactose bile， BGLB)肉汤：见附录 A.3。 6.4 结晶紫中性红胆盐琼脂 (violet red bile agar， VRBA)：见附录 A.4。 6.5 无菌磷酸盐缓冲液：见附录 A.5。 6.6 无菌生理盐水：见附录 A.6。 6.7 NaOH 溶液（ 1 mol/L）：见附录 A.7。 DB 15/T 184
7、9 2020 3 6.8 HCL 溶液（ 1 mol/L）：见附录 A.8。 7 MPN 计数法 7.1 采样 7.1.1 采样原则 样品采集应遵循随机性、代表性的原则。采样过程遵循无菌操作程序，防止一切可能的外来污染。 7.1.2 颗粒状或粉末样品 对送检样品包装内不同部位样品进行随机多点取样至少 250 g，充分混匀后称取 25 g颗粒状或粉末 状垫料样品，加入 225 mL无菌稀释液（磷酸盐缓冲液或生理盐水），充分振摇或均质 1 min 2 min，制 成 1:10的样品匀液。 7.1.3 平面样品 无菌操作将灭菌规格板（ 5 cm 5 cm）放在平面垫 料表面，用浸有无菌稀释液（磷酸缓
8、冲液或生理 盐水）的棉拭子，在规格板内来回均匀涂抹整个方格 3次，并随之转动棉拭子，然后用灭菌剪刀剪去棉 拭子与手接触的部分，将棉拭子头置入装有 25 mL无菌稀释液的无菌锥形瓶中，根据样品面积大小重复 采样 1 4个规格板面积，采样量见表 1，相应地将棉拭子头置入 25 mL 100 mL的无菌稀释液中，充分振 摇制成样品原液（ 1 mL原液对应的样品面积为 1 cm2）。取 1 mL样品原液注入含有 9 mL无菌稀释液的试 管中，制成 1:10的样品匀液。 表 1 不同面积平面类垫料样品采样量 样品面积 m2 采样量 cm2 规格板数 小于 0.25（含） 25 1 0.25 0.5（含）
9、 50 2 0.5 0.75（含） 75 3 大于 0.75 100 4 7.2 稀释 7.2.1 样品匀液的 pH应在 6.5 7.5 之间，必要时用 1 mol/L NaOH或 1 mol/L HCL调节。 7.2.2 用 1 mL无菌吸管或微量移液器吸取 1:10样品匀液 1 mL，沿管壁缓缓注入 9 mL磷酸盐缓冲液 或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用 1支 1 mL无菌 吸管或吸头反复吹打，使其混合均匀，制成 1:100的样品匀 液。 7.2.3 根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成 10倍递增系列稀释的样品匀液。每递增稀 释 1次
10、，换用 1支 1 mL无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过 15 min。 DB15/T 1849 2020 4 7.3 初发酵试验 每个样品选择 3个适宜的连续稀释度的样品匀液 (液体样品可以选择原液 )，每个稀释度接种 3管月 桂基硫酸盐胰蛋白胨（ LST）肉汤，每管接种 1 mL（如接种量超过 1 mL，则用双料 LST 肉汤）， 36 1 培养 24 h 2 h，观察导管内是否有气泡产生， 24 h 2 h产气者进行复发酵试验（证实试验）， 如未产气则继 续培养至 48 h 2 h，产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。 7.4 复发酵试验 (证实试验
11、) 用接种环从产气的 LST肉汤管中分别取培养物 1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（ BGLB）管中， 36 1 培养 48 h 2 h，观察产气情况。产气者计为大肠菌群阳性管。 7.5 大肠菌群最可能数 (MPN)的报告 按 7.4确证的大肠菌群 BGLB 阳性管数，检索 MPN 表（见附录 B），报告每 g（ cm2）样品中大肠菌 群的 MPN 值。 8 平板计数法 8.1 采样 按 7.1进行。 8.2 稀释 按 7.2进行。 8.3 平板计数 8.3.1 选取 2 3个适宜的连续稀释度， 每个稀释度接种 2个无菌平皿，每皿 1 mL。同时取 1 mL磷酸 盐缓冲液或生理盐水加入无菌平皿作空
12、白对照。 8.3.2 及时将约 15 mL 20 mL 融化并恒温至 45 50 的结晶紫中性红胆盐琼脂（ VRBA)倾注于每 个平皿中。小心旋转平皿，使培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，加 3 mL 4 mL VRBA琼脂覆盖平 板表层。凝固后翻转平板，于 36 1 培养 18 h 24 h。 8.4 平板菌落数的选择 选取菌落数在 15 CFU 150 CFU之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。 典 型 菌落为紫红色，菌落 周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为 0.5 mm或更大。 8.5 证实试验 从每个 VRBA平板上分别挑取 10个不同类型的典型和可疑菌落，少于
13、10个菌落的挑取全部典型和可疑 菌落。分别移种于 BGLB肉汤管内， 36 1 培养 24 h 48 h，观察产气情况。 BGLB肉汤管产气，可 报告为大肠菌群阳性。 8.6 大肠菌群平板计数结果计算与报告 DB 15/T 1849 2020 5 8.6.1 大肠菌群平板计数结果的计算 8.6.1.1 若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，分别计算经最后证实为大肠菌群阳性 的试管比例乘以 8.4中计数的平板菌落数，计算平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，即为每 g (cm2) 样品中大肠菌群数。例：加入 10-2样品稀释液的 2个 VRBA 平板上分别有 82 个和 64 个典型或可
14、疑菌落， 从每个平皿分别挑取其中 10 个菌落接种 BGLB肉汤管，分别证实有 7个和 8个阳性管，则该样品的大肠 菌群数为：（ 82 7/10+64 8/10） 102 2 =5.4 103 CFU/g (cm2)。 8.6.1.2 若有 2个连续稀释度的平板菌落数在适 宜计数范围内时，先计算适宜计数范围内每个平皿经 最后证实为大肠菌群阳性的菌落数，再按公式（ 1）计算样品中大肠菌群平板计数结果： dnn CN )1.0( 21 （ 1） 式中： N 样品中 大肠菌群板计数结果 ； C 平板（含适宜范围菌落数的平板） 证实为大肠菌群阳性的菌落数 之和； n1 第一稀释度（低稀释倍数）平板个数
15、； n2 第二稀释度（高稀释倍数）平板个数； d 稀释因子（第 一稀释度） 。 8.6.1.3 若所有平板上菌落数均大于 150 CFU，则对稀释度最高的平皿菌落进行确认，根据菌落确认 结果，利用 8.6.1.1中方法，计算样品中大肠菌群平板计数结果。 8.6.1.4 若所有平板上菌落数均小于 15 CFU，则应按稀释度最低的平皿菌落进行确认，根据菌落确认 结果，利用 8.6.1.1中方法，计算样品中大肠菌群平板计数结果。 8.6.1.5 若所有稀释度的平板菌落数均不在 15 CFU 150 CFU之间，其中一部分小于 15 CFU或大于 150 CFU时，则以最接近 15 CFU或 150
16、CFU，且稀释倍数较少的平皿菌落数进行确认，利用 8.6.1.1 中方法，计算样品中大肠菌群平板计数结果。 8.6.1.6 若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于 1乘以最低稀释倍数计算。 8.6.2 报告 8.6.2.1 大肠菌群平板计数结果按“四舍五入”原则修约。结果在 10 CFU以内时，采用一位有效数字 报告；结果在 10 CFU 100 CFU之间时，采用两位有效数字报告。 8.6.2.2 大肠菌群平板计数结果大于或等于 100 CFU 时，第 3位数字采用“四舍五入”原则修约后， 取前 2位数字，后面用 0代替位数来表示结果；也可用 10 的指数形式来表示，此时
17、按照“四舍五入” 原则修约，采用两位有效数字。具体 修约规则按照 GB/T 8170 执行。 8.6.2.3 若空白对照平板上有大肠菌群菌落出现，则此次检验结果无效。 8.6.2.4 以 CFU/g或 CFU/cm2为单位报告大肠菌群平板计数结果。 DB15/T 1849 2020 6 A A 附 录 A （规范性附录） 培养基和试剂 A.1 培养基制备及质量保证 按照 SN/T 1538.1和 SN/T 1538.2执行，并对制备好的培养基进行性能测试，如使用等效的脱水合成 培养基，使用前对其进行验收并按其说明书使用。 A.2 月桂基硫酸盐胰蛋白胨 (LST)肉汤 A.2.1 成分 胰蛋白胨
18、或胰酪胨 20.0 g 氯化钠 5.0 g 乳糖 5.0 g 磷酸氢二钾 ( K2HPO4) 2.75 g 磷酸二氢钾 (KH2PO4) 2.75 g 月桂基硫酸钠 0.1 g 蒸馏水 1000 mL A.2.2 制法 将上述成分溶解于蒸馏水中，调节 pH至 6.8 0.2，分装到有倒立发酵管的试管中，每管 10 mL， 121 高压灭菌 15 min备用。 A.3 煌绿乳糖胆盐 (BGLB)肉汤 A.3.1 成分 蛋白胨 10.0 g 乳糖 10.0 g 牛胆盐 20.0 g 0.1%煌绿水溶液 0.0133 g 蒸馏水 1000 mL A.3.2 制法 准确称取以上成分，加 1000 mL
19、蒸馏水，加热煮沸至完全溶解 ，调节 pH至 7.2 0.2，分装于有倒立 发酵管的试管中，每管 10 mL， 121 高压菌 15 min备用。 A.4 结晶紫中性红胆盐琼脂 (VRBA) DB 15/T 1849 2020 7 A.4.1 成分 蛋白胨 7.0 g 胆盐 1.5 g 酵母粉 3.0 g 乳糖 10.0 g 氯化钠 5.0 g 中性红 0.03 g 结晶紫 0.002 g 琼脂 15.0 g 蒸馏水 1000 mL A.4.2 制法 准确称取以上成分，加 1000 mL蒸馏水 ，静置几分钟，充分搅拌溶解，调节 pH至 7.4 0.1。煮沸 2 min， 将培养基融化并恒温至 4
20、5 50 倾注平板。使用前 3 h内制备。 A.5 磷酸盐缓冲液 A.5.1 成分 磷酸二氢钾 (KH2PO4) 34.0 g 蒸馏水 500 mL A.5.2 制法 贮存液：称取 34.0 g的磷酸二氢钾溶于 500 mL蒸馏水中，用大约 175 mL的 1 mol/L氢氧化钠溶液调 节 pH至 7.2 0.2，用蒸馏水稀释至 1000 mL后贮存于 4 冰箱。 稀释液：取贮存液 1.25 mL，用蒸馏水稀释至 1000 mL分装于适宜容器中， 121 高压灭菌 15 min 备用。 A.6 无菌生理盐水 A.6.1 成分 氯化钠 8.5 g 蒸馏水 1000 mL A.6.2 制法 称取
21、8.5 g氯化钠溶于 1000 mL蒸馏水中， 121 高压灭菌 15 min备用。 A.7 1 mol/L NaOH溶液 A.7.1 成分 氢氧化钠 40.0 g 蒸馏水 1000 mL DB15/T 1849 2020 8 A.7.2 制法 称取 40 g氢氧化钠溶于 1000 mL无菌蒸馏水中。 A.8 1 mol/L HCL 溶液 A.8.1 成分 HCL 90 mL 蒸馏水 1000 mL A.8.2 制法 量取浓盐酸 90 mL，用无菌蒸馏水稀释至 1000 mL。 DB 15/T 1849 2020 9 B B 附 录 B （规范性附录） 大肠菌群最可能数 (MPN)检索表 每
22、g(cm2)检样中大肠菌群最可能数 (MPN)的检索见表 B.1。 表 B.1 大肠菌群最可能数 (MPN)检索表 阳性管数 MPN 95%可信限 阳性管数 MPN 95 %可信限 0.1 0.01 0.001 上限 下限 0.1 0.01 0.001 上限 下限 0 0 0 1100 420 注 1： 本表采用 3个稀释度 0.1 g(mL)、 0.01 g(mL)和 0.001 g(mL)，每个稀释度接种 3管。 注 2： 表内所列检样量如改用 1 g(mL)、 0.1 g(mL)和 0.01 g(mL)时，表内数字要相应降低 10倍；如改用 0.01 g(mL)、 0.001 g(mL)、 0.0001 g(mL)时，则表内数字要相应提高 10倍，其余类推。 _
