1、ICS 07.080 B 40 DB15 内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准 DB15/T 1769 2019 代替蒙 DB 417 87 绵羊冷冻精液 Frozen sheep semen 2019-12-05发布 2020-01-05实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发布 DB15/T 1769 2019 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1 2009给出的规则 起草。 本标准代替蒙 DB 417 87羊冷冻精液。 本标准与蒙 DB 417 87羊冷冻精液相比，主要变化如下： 增加了规范性引用文件 (见第 2章）； 增加了试验方法 (见第 5章）； 增加了判定规则 (见第 6章）；
2、 修改了适用对象 (1987年版的引言；本版的第 1章第 2段）； 修改了规格与质量 (1987年版的第 2章；本版的第 4章）； 修改了检查方法 (1987年版的第 3章；本版的附录 A)； 删除了羊冷冻精液的制作程序和使用方法 (1987年版的第 2章和第 4章）； 删除了评定受胎效果 的方法（ 1987年版的附录 A)； 删除了羊冷冻精液包装颜色和公羊品种代号（ 1987年版的附录 B)。 本标准附录 A是规范性附录。 本标准由 内蒙古自治区畜牧工作站提出 。 本标准由 内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（ SAM/TC 19）归口 。 本标准主要起草单位：内蒙古自治区畜牧工作站、内蒙古
3、乐科生物技术有限公司、内蒙古赛诺种羊 科技有限公司。 本标准主要起草人：阿娜尔、海龙、苏雅、红海、高博、格力格桑、王建国、包花拉、宁策勒木格、 陈大勇、梁丽丽、孟怀德。 DB15/T 1769 2019 1 绵羊冷冻精液 1 范围 本标准规定了绵羊冷冻精液的技术要求 、检验方法、判定规则、标志、标签和随行文件等内容。 本标准适用于各品种绵羊的冷冻精液产品，以下简称冻精。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 4789.2 食品安全国家标准 食
4、品微生物学检验 菌落总数测定 GB 20557 山羊冷冻精液 GB/T 30396 牛冷冻精液包装、标签、贮存和运输 3 技术要求 3.1 种公羊 具有种用价值公羊，体质健康，无遗传病，不允许 有已发布的动物防疫法中所明确的二类疫病中的 任何一种 。 3.2 新鲜精液 色泽乳白色或淡黄色。精子活力 65 %，精子密度 6 108个 /mL。精子畸形率 15 %。 3.3 细管 冻精外观 细管无裂痕，两端封口严密，标识清晰，信息齐全。 3.4 每剂量冻精解冻后 3.4.1 剂型、剂量 细管冻精：微型， 0.18 mL。 3.4.2 精子活力 35 %（即 0.35）。 3.4.3 前进运动精子数
5、 1000万个。 3.4.4 精子畸形率 20 %。 DB15/T 1769 2019 2 3.4.5 菌落数 800个。 4 检验方法 4.1 外观 用目测法 ,其结果应符合 3.3的规定。 4.2 剂量 检验按附录 A中 A.2规定的方法 ,其结果应符合 3.4.1的规定。 4.3 解冻后每剂量精液 解冻方法及精子活力、前进运动精子数、精子畸形率、细菌菌落数的检验按照 A.3 A.6 规定的方 法，其结果应分别符合 3.4.2、 3.4.3、 3.4.4、 3.4.5的规定。 4.4 检验分类 4.4.5 常规检验 对冻精的单项目检验是型式检验的一部分，主要是在生产的冻精入库前和售出使用时
6、的检验。 4.4.6 型式检验 对冻精全部项目检验，评定产品质量是否全面符合标准，也是在生产方抽样检验、仲裁和质量监督 抽样检验时选定项的检验。 4.5 检验项目 4.4.5 常规检验 符合 3.3和 3.4.2的规定 。 4.4.6 型式检验 符合 3.3 3.4的规定。 5 判定规则 5.1 常规检验 样品中任何一项目检验未达到本标准中要求的规定，则判定为不合格。 5.2 型式检验 样品中任何一项目检验未达到本标准中要求的规定，则判定为不合格。 6 标志、标签和随行文件 6.1 标志、标签 DB15/T 1769 2019 3 6.4.5 细管标记 细管冻精应在管壁上依次印刷以下内容，并且
7、印制标识要清楚 ：生产站名、公羊品种、生产日期或 批次、公羊号。种公羊的品种代号按照 GB 20557的规定。 6.4.6 内标签 在贮精管、灭菌纱布袋上标注公羊个体号、品种、细管数量。 6.4.7 外标签 可参照 GB/T 30396的规定执行。 6.2 随行文件 绵羊冷冻精液产品可提供的随行文件包括：种公羊系谱、检疫证明、冷冻精液检验合格证明、生产 者的生产经营许可证等。 DB15/T 1769 2019 4 A A 附 录 A （规范性附录） 绵羊冷冻精液质量检验方法 A.1 导言 本附录规定了通用的绵羊冷冻精液质量检验方法，参照了 GB/T 4789.2的相关规定。 A.2 剂量检查
8、A.2.1 主要器材 小试管、剪刀。 A.2.2 检查方法 取三支细管冻精自然解冻后剪去两端，把精液倒入一小试管内，用 1.0 mL 吸管准确吸取精液，并 检测其精液量。 A.2.3 计算 三支冻精的剂量平均数为样品的剂量，按式 (A.1)计算 : 3 321 nnnQ （ A.1） 式中： Q 剂量值，单位为毫升（ mL）； n1 第一支样品剂量，单位为毫升（ mL）； n2 第二支样品剂量，单位为毫升（ mL）； n3 第三支样品剂量，单位为毫升（ mL）。 A.3 精子活力检查 A.3.1 器材、溶液 显微镜或显微电视装置、恒温水浴箱、 5.0 mL试管、载玻片或精液性状板、盖玻片（ 1
9、8 mm 18 mm） 、 显微镜保温箱或恒温装置、细管剪、 50 L移液器。 A.3.2 方法 三支细管分别直接置于 37 水浴中解冻，取解冻三支混合后精液约 50 uL置于载玻片上加盖玻片， 立即在载物台温度保持 38 的情况下用 200倍 400 倍显微镜观察活力，也可通过电视显微装置在荧 光屏上观察活力。每样片观察 3个视野，并应观察不同液层内的精子运动状态，进行全面评定。 DB15/T 1769 2019 5 A.3.3 计算 三个视野活力评价值的平均数按式 (A.2)计算： 3 321 nnnM （ A.2） 式中： M 精子活力； n1 第一视野活力； n2 第二视野活力； n3
10、 第三视野活力。 A.4 每剂量前进运动精子数的检查 A.4.1 主要器材 血球计数板、血色素管、 1 mL吸管、小试管、计数器、显微镜或电视显微装置、滴管、 3.0 %氯化 钠溶液。 A.4.2 检查方法 细管精液用血色素管准确吸取 20 uL解冻精液（也可使用 A.2已检查后的样品），注入盛有 0.98 mL 的 3.0 %氯化钠溶液的试管内，混匀，使之成为 50 倍稀释的稀释精液。将备好的血球计数板用血盖片 将计数室盖好，用小吸管吸取一滴稀释精液于血盖片边缘，使精液自行流人计数室，均匀充满，不允许 有气泡或厚度过大，然后在显微镜下或电视荧光屏上观察计数。 A.4.3 计算 a） 每剂量中
11、精子数 =5个中方格中的精子数 5（即计数室 25个中方格的总精子数） 10（ 1 mm3 内 的精子数） 1 000（每毫升精液的精子数） 50（细管稀释倍数） 剂量值。 上式可简化为： 每剂量中精子数 =5个中方格精子数 250万 (细管）剂量值 b） 每样品观察上下两个计数室，取平均值，如两个计数室计数结果误差超过 5 %，则应重检： c） 每剂量中呈前进运动精子数按式 (A.3)计算： msc （ A.3） 式中： c 每剂量中前进运动精子数，单位为个； s 每剂量中精子数，单位为个； m 活力， %。 A.5 精子畸形率的检查 A.5.1 器材、溶液 显微镜、载玻片、血球分类计数器、
12、小 吸管、蒸馏水、姬姆萨染料、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、甲 醛、甲醇、甘油。所用试剂为分析纯。 DB15/T 1769 2019 6 A.5.2 方法 A.5.2.1 溶液配制 A.5.2.1.1 磷酸盐缓冲液 磷酸二氢钠（ NaHPO4 2H2O） 0.55 g 磷酸氢二钠（ Na2HPO4 12H2O） 2.25 g 双蒸馏水定容至 100mL。 A.5.2.1.2 中性福尔马林固定液 40%甲醛 HCHO（使用前每 100 mL甲醛用 10.0 g碳酸镁饱和后过滤） 8.0 mL 磷酸二氢 钠（ NaHPO4 2H2O) 0.55 g 磷酸氢二钠（ Na2HPO4 12H2O） 2.25
13、g 用 0.89 %氯化钠约 50.0 mL 溶解后加入 8.0 mL 中和后的甲醛，再加 0.89 %氯化钠溶液定容至 100.0 mL。 A.5.2.1.3 姬姆萨原液 姬姆萨染料 1.0 g 甘油 C3H5(OH)3 66.0 mL 甲醇（ CH3OH） 66.0 mL 姬姆萨染料放入研钵中加少量甘油充分研磨至无颗粒为止，然后将甘油全部倒人并放入恒温箱中保 温继续溶解 4h，再加甲醇充分溶解混匀，过滤后贮于棕色瓶中待用，贮存时间越久染色效果越好。 A.5.2.1.4 姬姆萨染液 姬姆萨原液 2.0 mL 磷酸盐缓冲液 3.0 mL 蒸馏水 5.0 mL 现配现用。 A.5.2.2 制片染
14、色 精液解冻见 A.3,允许同时使用精子活力检查解冻的样品。 A.5.2.2.1 抹片 取解冻后精液一滴滴于载玻片一端，用另一边缘光滑的载玻片与有样品的载 玻片呈 35夹角，将 样品均匀地拖布于载玻片上，自然风干（约 5 min)。每样品制作两个抹片。 A.5.2.2.2 固定 在已风干的抹片上滴上 1.0 mL 2.0 mL中性福尔马林固定液，固定 15 min后用清水缓缓冲去固定 液，吹干或自然风干。 A.5.2.2.3 染色 将固定好后的抹片反扣在带有平槽的有机玻璃面上，把姬姆萨染液滴于槽和抹片之间，让其充满平 槽并使抹片接触染液，染色 1.5 h后用清水缓缓冲去染液，晾干待检。 DB1
15、5/T 1769 2019 7 A.5.2.3 镜检 将制备好的抹片在显微镜（ 400倍 600倍）下观察。每个抹片观察 200个以上的精子 (分左、右两 个区），取两片的平均值，两片 的变异系数不得大于 20 %，若超过应重新制片。 A.5.2.4 计算 精子畸形率按式（ A.4）计算： 1001 sAA （ A.4） 式中： A 精子畸形率， %； A1 畸形精子数，单位为个； s 精子总数，单位为个。 A.6 细菌数的检查 A.6.1 主要器材 培养箱、超净化工作台、三角烧瓶、烧杯、量筒、玻棒、天平、羊角匙、高压蒸汽灭菌锅（或微波 炉）、培养皿、水浴箱、 pH 试 纸（ pH 5.5 9
16、.0)、棉花、牛皮纸、记号笔、麻绳、纱布、放大镜、蒸馏 水、营养琼脂培养基。 A.6.2 培养基的配制 营养琼脂培养基：按 GB/T 4789.2规定执行。 A.6.3 检查方法 灭菌平皿事先标号。细管冻精 37 水浴解冻，用酒精棉球消毒以无菌操作，一支直接注于一个灭 菌平皿内；把已凉至 50 左右的普通琼脂以无菌操作倾倒入平皿内，每皿约 15 mL,并转动平皿使精液 混合均匀，同时做空白对照平皿。待琼脂凝固后翻转平皿，置 37 恒温箱内培养 48 h 取出，计数平 皿内菌落数。每头公羊样品取两支做两个平皿，取平均值。 A.6.4 计算 所检样品的细菌菌落数按式（ A.5）计算： 2 21 nnB （ A.5） 式中： B 细菌数，单位为个； n1 第一平皿菌落数，单位为个； n2 第二平皿菌落数，单位为个。 _
