1、ICS 07.080 B 40 DB15 内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准 DB15/T 1767 2019 代替 蒙 DB 476.1-88 马、驴冷冻精液 Frozen stallion(donkey) semen 2019-12-05发布 2020-01-05实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发布 DB15/T 1767 2019 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1 2009给出的规则起草。 本标准代替 蒙 DB 476.1-88马、驴冷冻精液。 本标准与蒙 DB 476.1-88相比主要变化如下： 增加了规范性引用文件 (见第 2章）； 增加了检验规则 (见第 5章）； 增
2、加了标志、标签和随行文件 (见第 6章）； 修改了规格与质量 (1988年版的第 2章；本版的第 4章）； 修改了检查方法 (1984年版的第 3章；本版的附录 A)； 修改了包装、运输和贮存（ 1984年版的第 4章；本版的第 7章 )； 增加了规范性附录“马驴冷 冻精液质量检验方法” (见附录 A)； 增加了规范性附录“种公马驴的品种代号” (见附录 B)。 本标准的附录 A、附录 B均为规范性附录。 本标准由内蒙古自治区畜牧工作站提出。 本标准由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（ SAM/TC 19） 归口。 本标准主要起草单位：内蒙古自治区畜牧工作站、鄂温克旗科兴马业发展有限公司 。
3、 本标准主要起草人：阿娜尔、海龙、红海、苏雅、陈龙梅、白丹丹、高博、葛根、安乐、金伟、格 力格桑 。 DB15/T 1767 2019 1 马、驴冷冻精液 1 范围 本标准规定了马、驴冷冻精液的命名、技术要求、检验规则、标志、标签和随行文件 、包装、运输 和贮存。 本标准适用于各品种马、驴冷冻精液产品。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 4789.2 食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定 GB/T 30396 牛冷冻精液包装、标签
4、、贮存和运输 3 技术要求 3.1 新鲜精液 色泽乳白色或淡黄色。精子活力（马 60 %、驴 65 %），精子密度 6000万个 /mL，精子畸形率 15 %。 3.2 细管冻精外 观 细管无裂痕，两端封口严密，标识清晰，信息齐全。 3.3 剂型、剂量 中型 0.40 mL。 3.4 每剂量冻精解冻后指标 3.4.1 精子活力 马 30 %（即 0.30），驴 35 %（即 0.35） 。 3.4.2 前进运动精子数 中型 3000万个。 3.4.3 精子畸形率 马 25 %，驴 20 %。 3.4.4 菌落数 1000个。 DB15/T 1767 2019 2 4 检验规则 4.1 外观 用
5、目测法。 4.2 剂量 按第 A.1 章的方法。 4.3 解冻后每剂量精液质量 解冻方法及精子活力、前进运动精子数、精子畸形率、菌落数的检验按照第 A.2 章第 A.5章规定 的方法 。 4.4 检验分类 4.4.1 常规检验 对马 、驴冷冻精液的单项目检验，是型式检验的一部分，主要是在生产的冻精入库前和售出使用时 的检验。 4.4.2 型式检验 对马、驴冷冻精液全部项目检验，评定产品质量是否全面符合标准，也是在生产方抽样检验、仲裁 和质量监督抽样检验时选定项的检验。 4.5 检验项目 4.5.1 常规检验 本标准中 3.2和 3.4.1规定。 4.5.2 型式检验 本标准中 3.2 3.4规
6、定。 4.6 判定 4.6.1 常规检验 样品中任何一项目检验未达到本标准中要求的规定，则判定为不合格。 4.6.2 型式检验 样品中任何一项目检验未达到本标准中要求的规定，则判定为不合格。 4.6.3 判定依据 其结果应分别符合本标准中 3.2 3.4的规定。 5 标志、标签和随行文件 5.1 标志、标签 DB15/T 1767 2019 3 5.1.1 细管标记 细管冻精应在管壁上依次印刷以下内容，并且印制标识要清楚：生产站名、公畜品种、生产日期或 批次、公畜号。 5.1.2 内标签 在贮精管、灭菌纱布袋上 标注马、驴个体号、品种、细管数量。 5.1.3 外标签 具体可参照 GB/T 30
7、396 的规定执行。 5.2 随行文件 马、驴冷冻精液产品可提供的随行文件包括：系谱、检疫证明、冷冻精液检验合格证明、生产者的 生产经营许可证等。 6 包装、运输和贮存 6.1 包装 细管冷冻精液包 装应在 -140 以下的环境中进行 。 将细管分类装入 贮精管， 包装后的细 管 冷冻精 液 其棉塞端应朝向贮精管的底部，不得倒置。 再用灭菌纱布袋将装有冷冻精液的 贮精管 包装起来，一个 灭菌纱布袋一个个体。 6.2 运输 细管冷冻精液运输过程中要有专人负责，贮存容器不得橫倒及碰撞和强烈振动，保证冷冻精液始终 浸在液氮中。 6.3 贮存 细管冷冻精液应浸没于液氮生物容器的液氮中。冷冻精液由一个液
8、氮生物容器转移到另一液氮生物 容器时，在液氮生物容器外停留时间不得超过 3 s。取存冷冻精液后要及时盖好液氮生物容器塞。 具体可参照 GB/T 30396 的规定执行。 DB15/T 1767 2019 4 A A 附 录 A （规范性附录） 马 、驴冷冻精液质量检验方法 A.1 剂量检查 A.1.1 主要器材 小试管、剪刀、 1.0 mL吸管、捡卵仪或洗耳球、细管专用推针。 A.1.2 检查方法 取两支细管冻精自然解冻后剪去封口端，用细管专用推针把精液推入一个小试管内，用 1.0 mL 吸 管准确吸取精液，并检测其精液总量。 A.1.3 计算 两支冻精的剂量平均数为样品的剂量，按式（ A.1
9、）计算： Q=n/2 (A.1) 式中： Q 剂量值，单位为毫升（ mL)； N 两 支样品总剂量，单位为毫升（ mL)； A.2 精子活力检查 A.2.1 主要器材 相差显微镜或相差显微系统、恒温水浴箱、 5.0 mL 试管、载玻片或精液性状板、盖玻片（规格 18 mm 18 mm）、显微镜保温箱或恒温装置、移液器。 A.2.2 检查方法 取二支细管冻精分别直接置于 37 水浴中解冻 30 s，取出细管用吸水纸擦干水珠，挤入 5.0 mL 试管内混匀，用移液器取精液 10 L 置于载玻片的一端，摇匀精液，取 10 L 精液置于载玻片的另一端， 盖上盖玻片后立即在（ 200 400）倍相差显微
10、镜下观察活力，也可通过相差显微系统在显示器上观察活 力 ，此时载物台温度应保持 37。每一样片观察盖玻片中央区域的活力，分别得出第一样片和第二样 片活力 n1和 n2。 DB15/T 1767 2019 5 A.2.3 计算 二个视野活力评定价值的平均数按式（ A.2）计算： M=(n1+n2)/2 (A.2) 式中： M 活力； n1 第一样片精子活力； n2 第二样片精子活力。 A.3 每剂量前进运动精子数检查 A.3.1 主要器材 血球计数板、血盖片、血色素管、移液器、 1 mL吸管、小试管、计数器、显微 镜或显微系统、 3.0 % 氯化钠溶液。 A.3.2 检查方法 细管精液用血色素管
11、或移液器吸取 10 L 解冻精液（也可使用第 B.2章已检查后的样品），注入盛 有 0.99 mL的 3.0 %氯化钠溶液的试管内，混匀，使之成为 100倍稀释的稀释精液。将备好的血球计数 板用血盖片将计数室盖好，用移液器吸取 10 L 稀释精液于血盖片边缘，使稀释精液自行流入计数室， 均匀充满，不允许有气泡，用同样方法为另一端计数室加样。静置 5分钟后在显微镜下或显微系统显示 器上观察计数上下两个计数室各 5 个中方格的精子数，取平均值。 A.3.3 计算 a) 每剂量中精子数 =5方格中的精子数 5（即计数室 25 个方格的总精子数） 10（即 1 mm3内的 精子数） 1000（即每 m
12、L 精液的精子数） 100（即稀释倍数）剂量值 上式简化为： 每剂量中精子数 =5个方格中的精子数 500 万（细管）剂量值 b) 每剂量中呈前进运动精子数按式（ A.3）计算： C=s m （ A.3） 式中： C 每剂量中前进运动精子数，单位为个； S 每剂量中精子数，单位为个； m 活力， %； A.4 精子畸形率的检查 A.4.1 主要器材 显微镜、载玻片、血球分类计数器、移液枪、蒸馏水、姬姆萨染料、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、甲 醛、甲醇、甘油、 伊红苯胺黑染液等 所用试剂为分析纯。 DB15/T 1767 2019 6 A.4.2 试剂配制 A.4.2.1 磷酸盐缓冲液 磷酸二氢钠（
13、NaH2PO4 .2H2O) 0.55 g 磷酸氢二钠（ NaHPO4 .12H2O) 2.25 g 双蒸馏水定容至 100 mL。 A.4.2.2 中性福尔马林固定液 40%甲醛 HCHO（使用前经碳酸 镁中和过滤） 8.0 mL 磷酸二氢钠（ NaH2PO4 .2H2O) 0.55 g 磷酸氢二钠（ NaHPO4 . 12H2O) 0.25 g 用 0.89%氯化钠约 50.0 mL 溶解后加入 8.0 mL 中和后的甲醛，再加 0.89 %氯化钠溶液定容至 100.0 mL。 A.4.2.3 姬姆萨原液 姬姆萨染料 10.0 g 甘油【 CH5（ CH） 3】 66.0 mL 甲醇（ C
14、H3OH) 66.0 mL 姬姆萨染料放入研钵中加少量甘油充分研磨至无颗粒为止，然后将甘油全部倒入并放入恒温箱中保 温继续溶解 4h，再加甲醇充分溶解混匀，过滤后贮于棕色瓶中代用，贮存时间越久染色效果越好。 A.4.2.4 姬姆萨染液 姬姆萨原液 2.0 mL 磷酸盐缓冲液 3.0 mL 蒸馏水 5.0 mL 现配现用。 也可购买商品化的姬姆萨染液，按产品说明使用。 A.4.2.5 伊红苯胺黑染液 伊红 Y（颜色指数 45380）染料 3.3 g 苯胺黑染料 20.0 g 柠檬酸钠 1.5 g 蒸馏水 300.0 mL 将苯胺黑染料 加入蒸馏水中 ， 边搅拌边加热 ， 直至完全溶解 ，然后加入
15、伊红染料， 边搅拌边加热 ， 溶解过程中要避免沸腾。调整 pH 值至 6.8 7.0， 染液保存 数天 后进行过滤 ，储存于暗色密封的玻璃瓶 中待用，在常温下，保存期 6 个月左右。也可购买商品化的伊红苯胺黑染液，按产品说明使用。 A.4.3 制片、染色、镜检、计算 精液解冻见 A.2，允许同时使用精子活力检查解冻的样品。 DB15/T 1767 2019 7 A.4.3.1 抹片染色法 抹片：取解冻后精液一滴滴于载玻片一端，用另一边缘光滑的载玻片与有样品的载玻片呈 35夹 角，将样品均匀地拖布于载玻片上，自然风干（约 30 min），每样品制作两个抹片。 染色：将固定好后的抹片反扣在带有平槽
16、的有机玻璃面上，把姬姆萨染液滴于槽和抹片之间，让其 充满平槽并使抹片接触染液，染色 1.5 h后用清水缓缓冲去染液，晾干待检。 镜检：将制备好的抹片在显微镜（ 400 倍 600 倍）下观察，并用血球分离计数器技术，每个抹片 观察 200 个以上的精子（分左右两个区），取两片的平均值，两片的变异系数不得大于 20 %，若超过 应重新制片。 精子畸形率按式（ A.4)计算： A=（ A1/S） 100 (A.4) 式中： A 精子畸形率， %； A1 精子畸形数，单位为个； S 精子总数，单位为个。 A.4.3.2 染色抹片法 染色：用移液 器取 5 L 10 L 伊红苯胺黑染液滴于载玻片的一端
17、，另取等量的经固定后的样品滴 于染液上，移液器吸放数次使样品与染液混匀成混合液。 抹片： 把凹玻片放置于混合液前端，下压凹玻片使混合液均匀地分布于二玻片之间，调整凹玻片与 磨砂载玻片间的角度，沿载玻片的表面拖拉混合液成涂片， 晾干待检 。 镜检在 1000 倍油镜下观察，计算方 法同 A.4.3.1。 A.5 菌落数的检查 A.5.1 主要器材 生化培养箱、超净化工作台、三角烧瓶、烧杯、量筒、玻棒、天平、牛角匙、高压蒸汽灭菌锅、 90 mm 培养皿、水浴锅、隔菌塞、记号笔、放大镜、蒸馏水等。 A.5.2 培养基的配制 使用营养琼脂培养基，其质量应符合 GB 4789.2。 A.5.3 检查方法
18、 灭菌平皿事先标号，细管冻精 37 水浴解冻，用酒精棉球消毒以无菌操作，一支直接注于一个灭 菌平皿内，把已凉至 50 左右的普通琼脂以无菌操作倾倒入平皿内，每皿约 15 mL，并转动平皿使精 液混合均匀，同时做空白对照平皿。待琼脂凝固后翻转平皿，置 37 恒温箱内培养 48 h 取出，计数 平皿内菌落数，取两支做两个平皿，取平均值。 DB15/T 1767 2019 8 A.5.4 计算 所检细管样品的菌落数按式（ A.5）计算： B=（ n1+n2） / 2 (A.5) 式中： B 菌落数，单位为个； n1 第一平皿菌落数，单位为个； n2 第二平皿菌落数，单位为个。 DB15/T 1767 2019 9 B B 附 录 B （规范性附录） 马、驴品种代号 B.1 原则和方法 以马、驴品种汉语名称第一和第二个字的汉语拼音的第一字母组合，字 数较多的包含第三、第四个 字母组合。驴品种最后加 L。 B.2 品种代号 品种代号见表 B.1。 表 B.1 种公畜品种代号 _ 公畜品种 品种代号 公畜品种 品种代号 蒙古马 MG 锡林郭勒 马 XLGL 阿巴嘎黑马 ABG 科尔沁马 KEQ 鄂伦春马 ELC 纯血马 CX 锡尼河马 XNH 库伦驴 KLL 三河 马 SH 德州驴 DZL
