1、ICS 65.020.20 B 05 DB15 内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准 DB15/T 1649 2019 蒙树 1号杨和蒙树 2号杨组培育苗技术规程 Tissue culture and rapid propagation technique guideline for Populus mengshu-1 and mengshu-2 2019-05-20 发布 2019-08-20 实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发布 DB15/T 1649 2019 I 目 次 前言 . II 1 范围 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3 术语和定义 . 1 4 环境及器具灭菌 . 1
2、 5 培养基配制 . 2 6 外植体及其灭菌 . 3 7 初代培养 . 4 8 继代培养 . 4 9 生根培养 . 4 10 炼苗 . 5 11 大田移栽 . 6 附录 A（资料性附录） MS 培养基母液配制表 . 7 DB15/T 1649 2019 II 前 言 本标准按照 GB/T1.1-2009给出的规则起草。 本标准由内蒙古自治区林业和草原局提出并归口。 本标准 起草单位：内蒙古和盛生态科技研究院有限公司、内蒙古和盛生态育林有限公司、内蒙古蒙 树生态 环境 有限公司、北京林业大学。 本标准起草人：赵泉胜、田菊、康向阳、铁英。 DB15/T 1649 2019 1 蒙树 1 号杨和蒙树
3、 2 号杨组培育苗技术规程 1 范围 本标准规定了蒙树 1号杨和蒙树 2号杨环境及器具灭菌、培养基配制、外植体采集及灭菌、初代培养、 继代培养、生根培养、炼苗、大田移栽等基本内容和技术要求。 本标准适用于蒙树 1号杨和蒙树 2号杨组织培养技术生产。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本 文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 LY/T 1882-2010 林木组织培养育苗技术规程 3 术语和定义 LY/T 1882-2010界定的以及下列术语和定义适用于本文件。 3.1 蒙树 1 号杨 P
4、opulus mengshu-1 以毛新杨 (Populus tomentosa P. bolleana)为母本，银灰杨 (P. canescens)为父本杂交而得的 雌株新品种。 3.2 蒙树 2 号杨 Populus mengshu-2 以毛新杨为母本，银灰杨为父本杂交而得 的雄株新品种 。 4 环境及 器具灭菌 4.1 准备 室消毒灭菌 经常用消毒液消毒，保持室内清洁。 4.2 接种室消毒灭菌 保持室内清洁。接种前用紫外灯照射 30 min 40 min，关闭紫外灯 20 min后方可进入。 4.3 培养室消毒灭菌 经常用消毒液对地面、组培架等设施进行消毒。 DB15/T 1649 20
5、19 2 4.4 超净工作台消毒灭菌 接种前应用紫外灯照射 30 min 40 min，打开无菌风吹 40 min以上；然后用 70 %酒精棉擦拭台面。 定期清洗超净工作台的过滤膜，具体方法：摘下滤膜，使用流水冲洗干净，晾干，安装，紫外灯照射灭 菌。 4.5 器具消毒灭菌 4.5.1 接种器具消毒灭菌 接种前，将接种工具 用滤纸包好，置于高压灭菌锅灭菌，要求温度 121 、时间 30 min。使用前用 酒精灯外焰灼烧 20 s以上，或用接种工具灭菌器直接灭菌。 4.5.2 污染瓶消毒灭菌 用高压灭菌锅消毒，然后再用自来水清洗培养瓶。 5 培养基 配制 5.1 基本培养基选择 选择 MS培养基为
6、基本培养基。 5.2 母液的配制和保存 5.2.1 母液的配制 MS培养基母液配制成几种化合物的混合母液， A液配制成 20倍母液， B、 C液配制成 100倍母液， D液 配制成 200倍母液， E液配制成 50倍母液，具体参数参见附录 A。 植物生长调节物质配制浓度为 0.5 mg/L。 5.2.2 母液的保存 母液配制 好后，标识清楚母液名称、倍数和配制日期，并置于 4 环境下存放。注意每瓶试剂在使 用前应目测无结晶、无异色时才能使用。 5.3 培养基 制备 5.3.1 准备工作 准备好蒸馏水、蔗糖、琼脂、各类母液和激素等试剂药品，同时准备好移液枪、量筒、量杯、天平、 药匙、 pH试纸等
7、工具。 5.3.2 蔗糖和 琼脂准备 按 30 g蔗糖 /L培养基液和 6 g琼脂 /L培养基液的用量称取蔗糖和琼脂的重量，置于加热容器中备用。 5.3.3 加母液 配制初代和继代培养基时，用量筒取 A液母液、 B液母液、 C液母液、 D液母液、 E液母液分别为 50 ml/L、 10 ml/L、 5 ml/L、 5 ml/L、 10 ml/L，混合均匀。 DB15/T 1649 2019 3 配制生根培养基时， A液母液、 B液母液、 C液母液、 D液母液、 E液母液分别为 25 ml/L、 10 ml/L、 5 ml/L、 5 ml/L、 10 ml/L，混合均匀。 配制初代培养基时，蒙树
8、 1号杨和蒙树 2号杨于混合液中均添加 6-BA 0.30 mg/L和 NAA 0.05 mg/L。 配制继代培养基时，蒙树 1号杨于混合液中添加 6-BA 0.30 mg/L和 IBA 0.20 mg/L，蒙树 2号杨于 混合液中添加 6-BA 0.50 mg/L和 IBA 0.2 mg/L。 配制生根培养基时，蒙树 1号杨于混合液中添加 IBA 0.30 mg/L和 NAA 0.20 mg/L，蒙树 2号杨于混 合液中添加 IBA 0.30 mg/L和 NAA 0.10 mg/L。 5.3.4 母液 定容 将量取好的母液定容至目标量。 5.3.5 加热溶解 将定容好的母液以及称量好的蔗糖和
9、琼脂混合在一起加热，待蔗糖和琼脂全溶解，且液体沸腾时停 止加热。 5.3.6 pH 值调节 充分搅拌后，用 1 mol/L的 HCl或 1 mol/L的 NaOH调节至 pH 5.8 6.0。 5.3.7 分装 使用 350 ml规格的培养瓶定量分装，每瓶分装约 50 ml。 5.3.8 封口 利用培养瓶配套瓶盖封口，拧紧瓶盖。 5.3.9 标记 封口后，在瓶盖上标注培养基名称、配制人、配制日期。 5.3.10 灭菌 8个小时内用高压灭菌锅灭菌，温度 121 ，时间 20 min。 5.3.11 冷却 灭菌后的培养基在凝固前取出，置于架上冷却凝固， 2 d 3 d观察无染菌情况后使用。 5.3
10、.12 贮存 灭菌后的培养基在室温条件下储存时，要在 7 d内使用完毕。 4 存储时，要在 15 d内使用完毕。 6 外植体 及其灭菌 6.1 外植体 采集 1 3月采集健壮、无病虫害的木质化枝条，进行切枝水培，选用新抽出的 5 cm 10 cm带腋芽嫩茎 段为外植体。 DB15/T 1649 2019 4 6.2 外植体灭菌 去掉 嫩茎的叶片和叶柄，在 20%洗洁精或洗衣粉水中浸泡 15 min后用毛笔将茎段刷洗干净，之后流 水冲洗 30 min，置于无菌培养瓶中转移到超净工作台。用 75%的酒精浸泡 10 s，倒出酒精后立即用 0.1% 升汞溶液浸泡 5 min，无菌水漂洗 5次去除残余消
11、毒液。 7 初代培养 7.1 初代培养基 选择 5.3.3中激素配比的初代培养基。 7.2 初代 接种 超净工作台中，在无菌滤纸上将灭菌后的嫩茎切成长度约 1 cm左右带腋芽的小段，每瓶培养基接种 1个小段，腋芽朝上斜插于培养基中，露芽，拧紧瓶盖，注明编号。 7.3 培养条件 培养温度为 25 2 ，光照强度为 2000 lx，光照周期为 14 h光 /10 h暗。 8 继代培养 8.1 继代培养基 选择 5.3.3中激素配比的继代培养基。 8.2 继代 转接 无菌外植体萌发的腋芽长到 3 cm 4 cm高时，进行继代转接。在超净工作台内，将初代培养的无根 瓶苗切成长度 2 cm左右的小段，每
12、个小段上 1 2个芽。每瓶培养基均接种 6 7个小段。小段形态学下端 插入培养基内，露芽，盖紧瓶盖，注明编号。 8.3 培养条件 培养温度为 25 2 ，光照强度为 2000 lx，光照周期为 12 h光 /12 h暗。 8.4 培养期 继代培养期为 20 d 30 d。 9 生根培养 9.1 生根培养基 选择 5.3.3中激素配比的生根培养基。 DB15/T 1649 2019 5 9.2 生根 转接 继代苗木长到 3 cm 4 cm高时，进行生根转接。在超净工作台内，将继代培养的无根瓶苗切成长度 2 cm左右的小段，每个小段上含 1 2个芽，每瓶培养基接种 8 10个小段。小段形态学下端插
13、入培养基 内，插入深度为 3 mm 5 mm，露芽，保持直立，盖紧瓶盖，注明编号。 9.3 培养条件 培养温度为 25 2 ，光照强度为 1500 lx，光照周期为 12 h光 /12 h暗。 9.4 培养 期 生根培养期为 25 d 30 d。 10 炼苗 10.1 瓶苗 炼苗 将高度为 3 cm 4 cm的瓶苗从组培室转移到温室苗床上进行过渡炼苗，控制环境温度 20 30 , 光照强度 1500 lx 2000 lx。一周后拧松瓶盖炼苗 1天。 10.2 温室穴盘 炼苗 10.2.1 炼苗 床搭建 在温室苗床上铺设防寒布进行防风、透气，搭建拱棚，拱棚高约 60 cm 70 cm，长度根据苗
14、床尺寸 定。拱棚外覆盖塑料薄膜保温保湿。 10.2.2 穴盘 选用上孔径 48 mm，底部 23 mm，深度 40 mm的穴盘。 10.2.3 基质 选用小于 6 mm粗草炭土： 1 mm 2 mm 粗蛭石： 3 mm 6 mm 粗珍珠岩 =3:2:1的混合物作为基质。 10.2.4 填装 基质 将 基质填充至穴盘中，并用竹块或木棍将穴盘中多余基质刮掉，喷淋透水后待用。 10.2.5 瓶苗 清洗 将组培苗取出，用 30 35 的温水轻轻洗去培养基，避免损根伤苗。置于 0.5 mg/L的多菌灵或 百菌清溶液中浸泡 3 min。 10.2.6 穴盘 栽植 移栽时，根要舒展且完全埋在基质中，并压实幼
15、苗周边基质，生长一致的苗木移栽至同一片穴盘中。 将栽满组培苗的穴盘整齐平放在炼苗床内，对塑料薄膜内侧和组培苗喷雾，封实塑料薄膜。 10.2.7 炼苗 操作 炼苗期间温度控制在 20 30 ，湿度控制在 60% 70%，炼苗期 14 d。 DB15/T 1649 2019 6 也可在温室内搭建小拱棚炼苗， 前 7天不揭开塑料薄膜，湿度控制在 60% 70%。第 8天，将塑料薄膜 四周松散开，使苗木接触拱棚外空气。第 9天，将拱棚两侧的半圆面塑料薄膜松开，自然垂在苗床外侧。 第 11天，揭开一侧半圆面的塑料薄膜。第 12天，揭开另一侧半圆面塑料薄膜。第 14天时，全部去掉塑料 薄膜，并浇透水。 1
16、0.2.8 养护 管理 揭膜后， 3 d喷雾一次， 15 d左右喷施一次 MS营养液。 10.2.9 炼苗期 温室穴盘炼苗所需时间约 45 d。当苗木半木质化且高度在 15 cm以上时，可移植至大田。 11 大田移栽 11.1 整地 对苗圃土地进行翻耕，深度约 30 cm。 11.2 灌溉 方式 采用 75 mm微喷带灌溉。 11.3 苗木栽植 将完成炼苗的穴盘苗转移至大田，切勿损伤苗木。取完整根系的穴盘苗，按照 30 cm 50 cm株行距 栽植，深度以根颈以上 2 cm 3 cm为宜。栽植后立即浇透水。 11.4 大田 管理 每 3 d 4 d浇水 1次，适时除草、松土。成活 2个月后，培
17、土埋住苗木基部以上 5 cm位置，促进苗木 生长更多根系。第 2年春季平茬。 MS 培养基液配制 DB15/T 1649 2019 7 A A 附 录 A （资料性附录） MS 培养基母液配制表 表 A.1 MS 培养基母液配制表 母液名称 编号 化试名称 浓度 mg/L 扩大倍数 扩大后称量 mg 母液定容体积 mL 配制培养基 吸取量 mL/L 大量元素 A NH4NO3 1650 20 33000 1000 50 KNO3 1900 20 38000 CaCl22H 2O 440 20 8800 MgSO47H 2O 370 20 7400 KH2PO4 170 20 3400 铁盐 B
18、 FeSO47H 2O 27.8 100 2780 1000 10 Na 2EDTA2H 2O 37.3 100 3730 微量元素 C MnSO4 4H2O 22.3 100 2230 500 5 ZnSO47H 2O 8.6 100 860 H3BO3 6.2 100 620 KI 0.83 100 83 Na2MoO42H 2O 0.25 100 25 CuSO45H 2O 0.025 100 2.5 CoCl26H 2O 0.025 100 2.5 有机成分 D 甘氨酸 2 200 400 1000 5 盐酸硫胺素 B1 0.1 200 20 盐酸吡哆酸 B6 0.5 200 100 烟 酸 0.5 200 100 E 肌醇 100 50 5000 500 10 注 ：母液需要在 4 左右的地方保存。 _
