1、ICS 07.080 B 40 DB15 内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准 DB15/T 1768 2019 代替 蒙 DB 476.2-88 马、驴冷冻精液制作技术规程 Technical code for producing frozen stallion（ donkey） semen 2019-12-05发布 2020-01-05实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发布 DB15/T 1768 2019 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1 2009给出的规则起草。 本标准代替 蒙 DB 476.2-88马、驴冷冻精液。 本标准与 DB 476.2-88相比主要变化如下： 增加了
2、规范性引用文件 (见第 2章）； 增加了术语和定义，并有中、英文对照 (见第 3章）； 增加了器械清洗和消毒 (见第 5章）； 增加了冻精镜检和检验规则 (见第 11章）； 增加了冻精包装 (见第 12章）； 增加了冻精贮存 (见第 13章）； 增加了冻精运输 (见第 14章）； 修改了种公马（驴）新鲜精液要求 (1988年版的第 2章；本版的第 4章）； 删除了使用方法中的输精 (1988年版的第 6章的 6.2）； 删除了评定受胎效果的方法（ 1988年版的附录 A）； 增加了规范性附录“细管冷冻精液标记方法” (见附录 A)； 增加了规范性附录“马驴冷冻精液稀释液配方” (见附录 B)；
3、 增加了资料性附录“马驴冷冻精液生产记录” (见附录 C表 C.1)。 本标准的附录 A、附录 B为规范性附录，附录 C为资料性附录。 本标准由内蒙古自治区畜牧工作站提出。 本标准由内蒙古自治区 畜牧业标准化技术委员会（ SAM/TC 19） 归口。 本标准起草单位：内蒙古自治区畜牧工作站、 鄂温克旗科兴马业发展有限公司 。 本标准主要起草人：阿娜尔、海龙、红海、格力格桑、苏雅、陈龙梅、白丹丹、葛根、安乐、金伟 。 DB15/T 1768 2019 1 马、驴冷冻精液制作技术规程 1 范围 本标准规定了马、驴冷冻精液制作的器械清洗和消毒、稀释液配制、采精、精液处理、精液冷冻、 精液解冻、冻精包
4、装、冻精贮存及冻精运输。 本标准适用于马、驴冷冻精液制作。 2 术语和定义 下列术语和定义使用于本文件。 2.1 假阴道 artificial vagina 模拟母马、 驴 阴道环境条件的采精工具，由外壳、内胎、过滤网、集精管等组成。 2.2 采精 semen collection 用人工模拟且有自然交配感的工具，以获得公马、 驴 精液的方法。 3 要求 3.1 种公马、驴 应具有种用价值，外貌评价为特级或一级，体质健康，无遗传病，不允许有已发布的动物防疫法中 所明确的二类疫病中的任何一种病。 3.2 新鲜精液 色泽乳白色或淡黄色。精子活力（马 60 %、驴 65 %），精子密度 6000 万
5、个 /mL，精子畸形率 15 %。 4 器械清洗和消 毒 4.1 玻璃器皿清洗和消毒 玻璃器皿使用后，用自来水浸泡。洗涤时，先在加有洗涤剂的温热溶液中进行刷拭，然后，用水冲 洗干净，最后，用蒸馏水冲洗，直至器皿光亮、无水滴附着为止。将洗净的玻璃器皿用锡箔纸封口后送 入消毒灭菌设备内，按操作说明进行干燥、消毒、灭菌后待用 。 DB15/T 1768 2019 2 4.2 采精器清洗 采精器使用后，用水冲去表面污物后在加有洗涤剂的温热溶液中用长毛刷刷洗，并用水冲洗干净， 再用蒸馏水逐个冲洗。将洗净的采精器放在架子上，其上覆盖两层清洁纱布（纱布应定期清洗、消毒）， 晾干备用。如发现内胎漏气、漏水或皱
6、折，应 及时更换或整理。 4.3 器械消毒 器械应进行消毒。金属镊子、药匙、胶塞和吸管滴头等用 75 %酒精棉球擦拭消毒，待酒精挥发尽 后方能使用，细管冷冻架使用前用紫外线消毒 30 min。 5 稀释液配制 稀释液配制 见 附录 B。 6 采精 6.1 采精准备 采精种公 马、驴应保持 体表干净，用 35 38 温水清洗其 阴茎 、 龟头，并用消毒 的纸巾和 毛 巾擦干。 6.2 采精操作 采精时把待采公 马、驴 牵到采精室内的台 畜 处，阻止其爬胯 （ 2 min 3 min） ，使其阴茎充分勃起。 采精员右手持 采精器具 ，待公 马、驴 爬跨 时，左手轻扳阴茎， 顺手导入采精器具 ，完成
7、射精后，小心地 取下集精杯，迅速转移至精液处理室。 6.3 采精频率 成年公 马、驴可 每周采精 3次 4次。 7 精液处理 7.1 准备 凡是接触精液的器皿 和离心液 均应放在 30 35 恒温箱中， 稀释液置于室温 （ 25 ） 备用。 盛装稀释精液的稀释管，应做明显标记。 7.2 预处理 采集的原精液传递入精液处理室后 ， 用 4层消毒 医用 纱布过滤，然后用肉眼观察精液的颜色，正常 精液色泽呈乳（灰）白色或淡黄色，记录原精液量（ mL） 。 7.3 密度测定 按精液密度测定仪的操作规程 准确进行精液的密度测定。测出密度后通过计算或精液密度测定仪的 程序获得应加稀释液量、可制作细管数等信
8、息。及时记录马（驴）号、采精量、密度、所加稀释液量、 制作细管数等有关数据。 DB15/T 1768 2019 3 7.4 镜检 取精液或稀释精液 10 L于载玻片上，加盖盖玻片后在 38恒温装置的相差显微镜上评定活力，活 力用百分率表示，例如 80 %或 0.8。镜检活力合格者进行稀释。 7.5 离心 按 1:1 的比例向原精液中加入离心液，放置 10 min， 将吸管深入离心管底部，注入 2 mL 的离心 垫， 按 1000 g， 离心 20 min（不使用离心垫，则 按 600 g 800 g， 离心 10 min）， 去掉上清液 ，去 除离心垫。 7.6 稀释 向 各离心管中 加入等温
9、 稀 释液 ，根据其活力、密度稀释，轻 轻混匀，并将所有离心后的精液收集 到一个大的离心管内。 7.7 封装和平衡 可使用细管分装一体机将精液分装到 0.5 mL细管中。 细管上所印字迹应清晰易认，信息齐全 。把 分装后的细管精液放入 避光容器中 ， 缓慢降温至 4 ， 平衡 1.5 h 4 h。 8 精液冷冻 8.1 上架 平衡后的精液放入冷冻槽内的冷冻架上， 如同一架上有不同公 马、驴 的细管精液，应分开码放，两 头公 马、 驴 细管冻精 之 间要隔开一些距离。 8.2 冷冻 使用全自动冷冻仪，按冷冻仪操作要求冷冻精液。 8.3 收集 冷冻完成后，打开冷冻容器盖子，冷冻精液按马、驴号投入盛
10、满液氮的不同提筒中，细管的超声波 封口端在上，棉塞封口端在下，不得倒置（以避免细管棉塞端的爆脱），并迅速浸泡在液氮中。 9 冻精解冻 预先把水浴箱水温加热至 37 40 ，用镊子取一支冷冻后的细管精液迅速浸泡入 37 40 水中并轻轻晃动，待溶解后立即取出，用吸水纸或纱布擦干水珠，再用细管剪剪去超声波封口端，滴 10 L精液于 载玻片上即可进行镜检。 10 冻精镜检和检验规则 10.1 镜检 镜检见 8.4。镜检合格者方可进行包装。 DB15/T 1768 2019 4 10.2 检验规则 冻精产品的质量应由相对独立的技术人员负责检测与监督，每季度每头公马、驴的冻精产品型式检 验不少于一次。当
11、生产冻精的重要原材料、器件等有重大改变影响到产品质量时应做型式检验。出站检 验合格，才可作为合格品交付。 11 冻精包装 用细管计数分装机进行包装，包装应在 -140 以下的环境中进行，包装后的细管其棉塞端在塑料 管的底部，不得倒置。塑料包装管的内径应均匀一致，不得用上口大、 底部小的塑料管。包装好的细管 精液入贮存库。 12 冻精贮存 冻精应贮存于液氮罐的液氮中，设专人保管，每周定时加一次液氮，应经常检查液氮罐的状况，如 发现液氮罐外壳结白霜，立即将精液转移入其他液氮罐内保存。包装好的冻精由一个液氮罐转换到另一 个液氮罐时，在液氮罐外停留时间不得超过 3 s。取存冻精后要盖好液氮罐塞，在取放
12、盖塞时，要垂直 轻拿轻放，不得用力过猛。移动液氮罐时，不得在地上拖行，应提握液氮罐手柄抬起液氮罐入贮存库。 13 冻精运输 冻精运输过程中应有专人负责，贮存容器不得横倒及碰撞和强烈振动。 DB15/T 1768 2019 5 公牛站代号三位数 公马（驴）场代号 棉塞封口端 超声波封口端 A 附 录 A （ 规范性 附录） 细管冷冻精液标记方法 A.1 概述 细管冷冻精液标记由十六位数四部分组成，排列顺序如下： A.2 方法 第一部分马、驴场代号，不得超过 4个字母；第二部分品种代号以蒙 DB 476.1为依据；第三部分冻 精生产日期六位数按年月日次序排列，年月日各占二位数字，年度的后两位数组成
13、年的二位数，月、日 不够二位数的，月、日前分别加“ 0”补充为二位数。第四部分马、驴号取该马、驴芯片号码的后五位 数。部分与部分之间空一个汉字（二个字节）， 第一、第二部分用汉语拼音大写字母表示，标记的字迹 必须清晰易认。 A.3 标记示例 注： KXMY为鄂温克旗科兴马业发展有限公司代号， SH为三河马的品种代号， 170819为 2017年 8月 19日的生产日期代 号， 09002为该公马芯片号码 TQJD 09002的后五位数。 第一部分 第一 部分 第一部分 第一部分 品种代号二位数 冻精生产日期六位数 公马（驴）号五位数 KXMY SH 170819 09002 DB15/T 17
14、68 2019 6 A B 附 录 B （资料性附录） 马、驴冷冻精液稀释液配方 B.1 所有器具应洁净并消毒灭菌。 B.2 所用试剂均为分析纯 ，稀释用水为 双蒸水或超纯水（ 18.2兆欧）。 B.3 驴用稀释液配方如下 ： 配方 1。 离心液： Tris3.36 g、 柠檬酸 1.88 g、 葡萄糖 1.53 g、甘油 7 mL、青链霉素各 5万单位、 水 93 mL； 冷冻稀释液：离心液 73 mL、卵黄 20 mL、甘油 7 mL。 配方 2。 离心液： 0.9 %氯化钠溶液。 冷冻稀释液：葡萄糖 5 g、乳糖 3 g、柠檬酸钠 0.3 g、 EBTA 0.1 g、甘油 5 mL、卵黄
15、 20 mL、青链霉素各 10万单位，水 75 mL。 配方 3。 离心液： 0.9 %氯化钠溶液； 冷冻稀释液：葡萄糖 6 g、果糖 2 g、 EBTA 0.1 g、甘油 5 mL、卵黄 20 mL、青链霉素各 10万单位，水 75 mL。 B.4 马用稀释液配方如下： 配方 1。 离心液： 7 %葡萄糖溶液； 冷冻稀释液：乳糖 11 g、果糖 4 g，甘油 5 mL、卵黄 20 mL、青链霉素各 10万单位，水 75 mL。 配方 2。 离心液：葡萄糖 2.20 g、乳糖 3.70 g、海藻糖 0.80 g、谷胱甘肽 0.077 g、柠檬酸钠 0.60 g、脱脂奶 40 mL、卵黄液 3.5 mL、青链霉素各 10万 IU、水 100 mL； 冷冻稀释液：离心液 95.5 mL、甘油 4.5 mL。 B.5 也可使用商品化稀释液。 DB15/T 1768 2019 7 B C 附 录 C （资料性附录） 马、驴冷冻精液生产记录 表 C.1 马、驴冷冻精液生产记录表 _
