1、ICS 65.020.20 B 05 DB15 内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准 DB15/T 1611 2019 细叶百合组织培养技术规程 Technical regulation of tissue culture of lilium pumilum 2019-03-15 发布 2019-06-15 实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发布 DB15/T 1611 2019 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由内蒙古蒙草生态环境（集团）股份有限公司提出。 本标准由内蒙古自治区草原生态修复标准化技术委员会（ SAM/TC34）归口。 本标准起草单位
2、：内蒙古蒙草生态环境（集团）股份有限公司。 本标准主要起草人：高秀梅、田志来、马怀林、张永清、李晶晶、白俊梅、崔海鹏、刘思泱。 DB15/T 1611 2019 1 细叶百合组织培养技术规程 1 范围 本标准规定了细叶百合组织的相关术语和定义、实验室设施与要求、培养基制备和组织培养过程。 本标准适用于细叶百合规模化组培育苗生产。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 603-2002 化学试剂 试验方法中所用制剂及制品的制备 NY/T 230
3、6-2013 花卉种苗组培快繁技术规程 3 术语和定义 下列 术语和定义适用于本文件。 3.1 细叶百合 lilium pumilum 细叶百合别名山丹、卷莲花，为多年生百合科草本植物。 3.2 结球培养 bulb-inducted 将增殖的丛生芽接种到结球培养基中促进鳞茎形成的过程。 4 实验室设施与要求 试验室 设计与设施按照 NY/T 2036-2013， 4.1.3执行。 5 培养基的制备 5.1 培养基的配制 MS培养基母液的配制顺序及比例参见附录 A， 配制使用蒸馏水。大量元素按照比使用浓度高 10 100 倍进行配制，微量元素按照比使用浓度高 20 1000倍进行配制，作为贮备液
4、。 5.2 植物 生长调节剂母液的配制 DB15/T 1611 2019 2 5.2.1 配制 植物 生长调节剂母液的配制浓度为 6-BA 0.2 mg/L 2.0 mg/L， NAA 0.1 mg/L 0.5 mg/L。 5.2.2 储存 配制 好的母液贴上标签，注明名称和日期，保存于 4 冰箱中，尽快使用。 5.2.3 其他物质 用 3.5 g/L卡拉胶作固化剂， 3 %的食用白糖代替蔗糖作为碳源。 5.3 培养基的制作 5.3.1 母液配制 按 照附录 A依次取 MS母液，大量元素 50 ml/L、微量元素 5 ml/L、铁盐 5 ml/L、有机成分 5 ml/L，根 据生长要求加入植物
5、生长调节剂（不耐高温的药品，应在培养基灭菌后再过滤灭菌加入），加入 3.5 g/L 卡拉胶、 3 %的食用白糖，贴上标签，注明名称和日期，保存于 4 冰箱中，尽快使用。 5.3.2 定容 取出 母液，用玻璃棒搅拌混匀，加入沸腾的自来水并不断搅拌使卡拉胶和糖溶解，加水至容器刻度 （ 1 L或 10 L）。 5.3.3 pH 值调试 定容 后调试 pH值，用 0.1 mol/L的 HCl或 NaOH溶液，调 pH为 5.8 6.0。配制溶液方法按照 GB/T 603 执行。 5.3.4 分装 将 调好的培养基根据不同需求进行分装，增殖培养基规格为容量 300 ml的培养瓶，每瓶分装 60 ml 7
6、0 ml；生根培养基，每瓶分装 40 ml 50 ml。 5.3.5 封口 培养 瓶用封口膜或者瓶盖封口，用绳子扎紧或者拧紧。 5.3.6 灭菌 将 捆绑好的培养瓶尽快进行高压灭菌， 121 灭菌 20 min 25 min。 5.3.7 储存 灭菌 后的培养基标明编号及日期，冷却和凝固后放置观察 2 d 3 d，按灭菌先后顺序使用，且存储 时间不超出一个月。 6 组织培养过程 6.1 外植体的选取及灭菌 DB15/T 1611 2019 3 6.1.1 外植体选取 在 春季将要出芽或者刚出芽时，取其中层鳞片。 6.1.2 外植体灭 菌 外植体灭菌流程为 : a) 鳞片稍加冲洗去掉泥土； b)
7、 在超净台放入无菌容器中； c) 在每升滴加 2 3 滴“ Tween-20”的洗涤剂溶液中浸泡 60 s； d) 转入 75 %的酒精中浸泡 30 s； e) 再用 0.15 %的升汞溶液处理 20 min； f) 无菌水淋洗 3 4 次； g) 无菌滤纸上吸干水分，直接接入预先配制好的培养基中。 6.2 培养条件 培养 温度为： 25 1 ，光照强度 2500 Lx，除自然光照外，夜间补光 4 h/d。 6.3 初代培养 将 中层鳞片接入到培养基 MS+6-BA 0.5 mg/L 2.0 mg/L +NAA 0.1 mg/L 0.5 mg/L +VC 5 mg/L中。 6.4 继代培养 将
8、 诱导分化出的 1 cm 3 cm不定芽切成单株，接种到增殖培养基 MS+6-BA 0.2 mg/L 2.0 mg/L +NAA 0.01 mg/L 0.3 mg/L ，约 10 d后底部开始愈伤化，约 45 d后可继续继代增殖培养。 6.5 结球培养 将 增殖的丛生芽接种于 1/2MS+IBA 0.5 mg/L+2%食用白糖的结球培养基中，诱导鳞茎形成，促进结 球。 6.6 生根培养 将 长 3 cm 4 cm的组培苗，分成单株接种于 1/2MS+IBA 0.5 mg/L生根培养基上 ,培养 15 d 20 d后 移栽。 6.7 炼苗 将 生长健壮、根长到 1 cm 2 cm的组培苗进行炼苗
9、，前 2 d闭瓶炼苗，而后 2 d 3 d开瓶炼苗。 6.8 移栽 将培养苗从培养瓶中倒出，清水洗净根部残留的培养基，用 50 ppm的 IBA沾根 8 min后，栽入栽培基 质中，基质成分为蛭石 +羊粪 +磷酸二铵。当组培苗长至 3 4片真叶后，可移入假植圃假植或直接定植， 在此期可适量施稀释的复合肥。 DB15/T 1611 2019 4 A A 附 录 A （资料性附录） MS 培养基成分表 表 A.1 MS 培养基成分表 成分 MS 贮备液配制浓度 mg/L 每升培养基取用量 ml 大量元素 NH4NO3 KNO3 CaCl2H2O MgSO47H2O KH2PO4 33000 38000 8800 7400 3400 50 微量元素 KI H3BO3 MnSO44H2O ZnSO47H2O Na2MoO42H2O CuSO45H2O CoCl26H2O 166 1240 4460 1720 50 5 5 5 铁盐 FeSO47H2O Na2EDTA2H2O 5560 7460 5 有机成分 肌醇 烟酸 盐酸吡哆醇 烟酸硫胺素 甘氨酸 20000 100 100 20 400 5 _
