1、ICS 65.020.20 B 05 DB15 内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准 DB15/T 1610 2019 黄花矶松组织培养技术规程 Technical regulation of tissue culture of limonium aureum 2019-03-15发布 2019-06-15实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发布 DB15/T 1610 2019 I 目 次 前言 . 1 范围 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3 实验室要求与设施 . 1 4 培养基的制备 . 1 5 组织培养过程 . 2 附录 A（资料性附录） B5基础培养基成分 . 4 DB15/T
2、1610 2019 II 前 言 本标准 按照 GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由内蒙古蒙草生态环境（集团） 股份有限公司提出。 本标准由内蒙古自治区草原生态修复标准化技术委员会 (SAM/TC34)归口。 本标准起草单位：内蒙古蒙草生态环境（集团）股份有限公司。 本标准主要起草人：高秀梅、田志来、马怀林、张永清 、李晶晶、白俊梅、崔海鹏、刘思泱 。 DB15/T 1610 2019 1 黄花矶松组织培养技术规程 1 范围 本标准规定了黄花矶松组织培养中的实验室要求与设施、培养基的制备和组织培养过程。 本标准适用于内蒙古地区黄花矶松组培苗的规模化育苗生产。 2 规范性引用文件
3、 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本 文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 603 化学试剂 试验方法中所用制剂及制品的制备 NY/T 2306-2013 花卉种苗组培快繁技术规程 3 实验室要求与设施 实验室设计与设施按照 NY/T 2036-2013， 4.1.3执行。 4 培养基的制备 4.1 培养基的配制 B5培养基母液的配制顺序参见附录 A，配制使用蒸馏水。大量元素按照比使用浓度高 10 100倍进 行配制，微量元素按照比使用浓度高 20 1000倍进行配制，作为贮备液。 4.2 植物
4、生长调节剂母液的配制 4.2.1 配制 植物生长调 节剂母液的配制浓度为 KT 0.2 mg/L 0.8 mg/L、 NAA 0.05 mg/L 0.1 mg/L、 2,4-D 0.02 mg/L 0.08 mg/L、 IBA 0.1 mg/L。 4.2.2 保存 配制好的母液贴上标签，注明名称和日期，保存于约 4 冰箱中，尽快使用。 4.2.3 其他物质 用 3 g/L 5 g/L卡拉胶作固化剂， 25 g/L 35 g/L的食用白糖代替蔗糖作为碳源。 DB15/T 1610 2019 2 4.3 培养基的制作 4.3.1 母液配制 烧杯中加入 3 g/L 5 g/L卡拉胶， 25 g/L
5、35 g/L的食用白糖，按照附录 A依次取大量元素、微量 元素、铁盐、有机成分，根据生长要求加入植物生长调节剂（不耐高温的药品，应在培养基灭菌后再过 滤灭菌加入），贴上标签，注明名称和日期，保存于 4 冰箱中 ，尽快使用。 4.3.2 定容 取出母液，用玻璃棒搅拌混匀，加入沸腾的自来水并不断搅拌使卡拉胶和糖溶解，加水至容器刻度 （ 1 L或 10 L）。 4.3.3 pH调试 定容后用 0.1 mol/L的 HCl或 NaOH溶液，调节 pH为 5.8 6.0。配置溶液方法按照 GB/T 603执行。 4.3.4 分装 将调节好的培养基根据不同需求进行分装，诱导培养基规格为容量 300 ml的
6、培养瓶，每 瓶分装 40 ml 50 ml；增殖培养基规格为容量 300 ml 的培养瓶，每瓶分装 40 ml 50 ml；生根培养基，每瓶分 装 30 ml 40 ml。 4.3.5 封口 分装好的培养瓶用封口膜或者瓶盖进行封口，并用绳子扎紧或拧紧。 4.3.6 灭菌 将封口后的培养瓶在 121 中灭菌 20 min 25 min。 4.3.7 存储 灭菌后的培养基应标明编号及日期，冷却和凝固后放置观察 2d 3d，按灭菌先后顺序使用，且存 储时间不超出一个月。 5 组织培养过程 5.1 外植体的选取及灭菌 5.1.1 外植体选取 5.1.2 外植体灭菌 外植体灭菌流程为： a) 用流水冲洗
7、 30 min 40 min； b) 转入超净工作台，吸水纸吸去水分后在 70 % 75 %酒精中处理 1 min 2 min，再用 0.1 %的 升汞溶液处理 8 min 10 min； c) 无菌水淋洗 6 7次，用已灭菌的滤纸吸干，接种在备好的培养基中。 DB15/T 1610 2019 3 5.2 培养条件 培养温度为 25 2 ；光照强度为 1500 Lx 2000Lx；光照时间为 12 h/d 16 h/d。 5.3 初代培养 将外植体接种到 B5+KT 0.2 mg/L 0.8 mg/L + NAA 0.05 mg/L 0.1 mg/L+2,4-D 0.02 mg/L 0.08
8、mg/L初 代诱导培养基上，培养 15 d后产生愈伤组织， 20 d左右可产生结构紧密，淡绿色的不定芽。 5.4 继代培养 将诱导出的不定芽取出，接种于 B5+KT 0.5mg/L 0.8 mg/L+ NAA 0.05 mg/L 0.1 mg/L继代增殖 培养基上， 30 d 后基础苗分裂的成熟细胞转变为具有分裂能力的细胞生长出健壮、茂密、叶色正绿带 有 2片叶子的无根小苗。需要大量生产时，可重复此过程。 5.5 生根培养 将继代培养中带有叶尖的不定芽，分成单株转入培养基 B5 IBA 0.1mg/L中进行生根培养，附加食 用白砂糖 25 g/L 35 g/L，卡拉胶 3 g/L 5 g/L，
9、 7d后约 85 %的基础苗生根，根系发达，生长势表现 良好。 5.6 炼苗 当根长约 1 cm，且具有两条以上根系时，将组培苗移入温度为 20 25 ，湿度为 80 %的环境 中炼苗 16 d。闭瓶苗移到光照为 2000 Lx的自然光下照射 6 d，再除去封口材料炼苗 10 d。 5.7 移栽 炼苗后洗净根部残留的培养基，移入栽培基质中，基质配比为蛭石 +珍珠岩（ 3:2），缓苗期间控制 适宜温湿度，勿积水。 DB15/T 1610 2019 4 A A 附 录 A （资料性附录） B5 基础培养基成分 表 A.1 B5基础培养基成分 成分 使用浓度 mg/L 大量元素 (NH4)2SO4 KNO3 CaCl2H2O MgSO47H2O NaH2PO4 134 2500 150 250 150 微量元素 KI H3BO3 MnSO44H2O ZnSO47H2O Na2MoO42H2O CuSO45H2O CoCl26H2O 0.75 3.0 10 2.0 0.25 0.025 0.025 铁盐 FeSO47H2O Na2EDTA2H2O 27.8 37.3 有机成分 肌醇 烟酸 盐酸吡哆醇 烟酸硫 胺 谷氨酰胺 100 1.0 1.0 10 800 _
