1、ICS 65.120 B 46 DB15 内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准 DB15/T 1594 2019 青贮饲料中微生物数量测定方法 Code for measuring microorganism counts in silage 2019-02-20发布 2019-05-20实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发布 DB15/T 1594 2019 I 目 次 前言 . II 1 范围 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3 术语和定义 . 1 4 方法 . 2 5 仪器设备 . 2 6 培养基和试剂 . 2 7 测定程序 . 3 8 分析步骤 . 3 9 微生物数量计算 . 3
2、 附录 A（资料性附录） 培养基 . 4 DB15/T 1594 2019 II 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由内蒙古自治区农牧业科学院提出。 本标准由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（ SAM/TC19）归口。 本标准起草单位：内蒙古自治区农牧业科学院、内蒙古农业大学、中国农业科学院草原研究所、沈 阳农业大学、内蒙古草都饲草料研究院、内蒙古自治区草原勘察规划院。 本标准主要起草人： 孙林、薛艳林、格根图、张福金、殷国梅、孙杰 、赵和平、孙娟娟、白春生、 王志军、羿静、张欣昕、刘广华、范文强、张园园、刘思博、张琼琳。 DB15/T 1594 2019
3、 1 青贮饲料中微生物数量测定方法 1 范围 本标准规定了青贮饲料中乳酸菌、大肠杆菌、细菌、霉菌和酵母菌数量测定的方法、仪器设备、培 养基和试剂、测定程序、分析步骤、数量计算。 本标准适用于内蒙古地区青贮饲料中微生物数量测定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验 室用水规格和试验方法 GB/T 14699.1 饲料 采样 3 术语和定义 3.1 青贮饲料微生物 microorganism in silage 青贮饲料中的
4、乳酸菌、大肠杆菌、细菌、霉菌和酵母菌等微生物。 3.2 乳酸菌数量 lactic acid bacteria count 青贮饲料样品经过处理，在一定的培养成分、温度和时间下培养后，所得 1 g 试样中所含乳酸菌数 量。 3.3 大肠杆菌数量 coliform bacteria count 青贮饲料样品经过处理，在一定的培养成分、温度和时间下培养后，所得 1 g试样中所含 大肠杆菌 的数量。 3.4 细菌数量 bacteria count 青贮饲料样品经过处理，在一定的培养成分、温度和时间下培养后，所得 1 g试样中所含好氧细菌 数量。 DB15/T 1594 2019 2 3.5 霉菌数量
5、moulds count 青贮饲料样品经过处理，在一定的培养成分、温度和时间下培养后，所得 1 g试样中含霉菌数量。 3.6 酵母菌数量 yeasts count 青贮饲料样品经过处理，在一定的培养成分、温度和时间下培养后，所得 1 g试样中含酵母菌数量。 3.7 菌落形成单位 colony-forming units， CFU 在琼脂平板上经过一定温度和时间培养后形成的每一个菌落，是计算微生物数量的单位。 4 方法 根据青贮饲料中微生物生理特性，选择分别适宜于真菌、细菌、大肠杆菌和乳酸菌生长的培养基， 采用平板计数方法，测定微生物数量 。 5 仪器设备 5.1 分析天平，感量 0.001 g
6、。 5.2 恒温培养箱： 36 1 。 5.3 高压灭菌器：灭菌压力 0-3 kg/cm2。 5.4 振荡器：往复式。 5.5 涡旋震荡器： 2900 r/min。 5.6 灭菌玻璃三角瓶： 250 mL， 500 mL。 5.7 灭菌试管： 15 mm 150 mm。 5.8 灭菌培养皿：直径 90 mm。 5.9 灭菌吸管： 1 mL， 10 mL。 5.10 灭菌玻璃珠：直径 5 mm。 5.11 水浴锅：（ 45 77） 1 。 5.12 超净工作台。 6 培养基和试剂 6.1 乳酸菌培养基： MRS琼脂，见附件 A.1。 6.2 大肠杆菌培养基：结晶紫中性红胆盐琼脂，见附件 A.2。
7、 6.3 细菌培养基：营养琼脂，见附件 A.3。 6.4 霉菌培养基：马铃薯葡萄糖琼脂，见附件 A.4。 6.5 酵母菌培养基：马铃薯葡萄糖琼脂，见附件 A.4。 6.6 稀释液：称取氯化钠 8.5 g，溶于 1000 mL 蒸馏水中，分装后， 121 高压灭菌 30 min。 6.7 除特殊注明，所用试剂均为分析纯；水符合 GB/T 6682 三级水规格。 DB15/T 1594 2019 3 6.8 实验 室常用消毒试剂。 7 测定程序 青贮饲料微生物数量测定程序图见图 1。 图 1 青贮饲料微生物数量测定程序图 8 分析步骤 8.1 按照 GB/T 14699.1中的规定执行，采样时注意
8、样品的代表性和避免污染。 8.2 菌液制备 以无菌操作称取 25 g 青贮样品放入装有 225 mL灭菌稀释液的玻璃三角瓶中，封口后置 振荡器上，振荡 30 min，即为 1:10的菌液。 8.3 用灭菌吸管吸取 1:10 菌液 10 mL，注入灭菌试管中，置涡旋震荡器上混合 3 min，使微生物充分 分散成单个细胞。 8.4 用灭菌吸管吸取 8.3的菌液（ 1:10） 1 mL，注入含有 9 mL 灭 菌稀释液试管中，置涡旋震荡器上混 合 1 min，此液为 1:100菌液。 8.5 按照上述操作顺序作 10倍递增稀释，每稀释一次，换用一支 1mL 灭菌吸管；根据对样品情况的估 计，选择三个
9、合适稀释度；吸取 1 mL 所选稀释度菌液于灭菌培养皿中，每个稀释度作两个培养皿。 8.6 菌液移入培养皿后，应及时将至 45 至 60 的培养基注入培养皿约 15 mL 并转动培养皿使混 合均匀。 8.7 待培养基凝固后，翻转培养皿，倒置于恒温（乳酸菌： 30 厌氧，大肠杆菌、细菌、霉菌和酵母 菌： 30 ）培养箱中，培养 24 h 至 96 h（乳酸菌： 72 h，霉菌 和酵母菌： 96 h，大肠杆菌： 24 h， 细菌： 96 h）后开始观测计数。 8.8 选取乳酸菌、大肠杆菌、细菌或酵母菌等菌落数在 30 CFU 300 CFU 之间的培养皿进行计数，选 取霉菌菌落数在 10 CFU
10、100 CFU之间的培养皿进行计数；每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均 数。 9 微生物数量计算 青贮饲料中乳酸菌、大肠杆菌、细菌、霉菌和酵母菌数量按公式（ 1）计算： N = (C10 n-1250)/25 （ 1） 式中 : N 每克青贮饲料中微生物数量，单位为 CFU/g； C 相同稀释度两个培养皿上菌落数的平均值； n 稀释度。 DB15/T 1594 2019 4 A A 附 录 A （资料性附录） 培养基 A.1 MRS琼脂 A.1.1 成分 蛋白胨 10.0 g 牛肉粉 5.0 g 酵母粉 4.0 g 葡萄糖 20.0 g 吐温 80 1.0 mL K2HPO47H2O 2.
11、0 g 醋酸钠 3H2O 5.0 g 柠檬酸三铵 2.0 g MgSO47H2O 0.2 g MnSO44H2O 0.05 g 琼脂粉 15.0 g A.1.2 制法 将上述成分加入到 1000 mL蒸馏水中，加热溶解，调节 pH至 6.2 0.2，分装后 121 高压灭菌 15 min。 A.2 结晶紫中性红胆盐琼脂 A.2.1 成分 蛋白胨 7.0 g 酵母膏粉 3.0 g 乳糖 10.0 g 氯化钠 5.0 g 3号胆盐 1.5 g 中性红 0.03 g 结晶紫 0.002 g 琼脂 15.0 g A.2.2 制法 将上述成分加入到 1000 mL蒸馏水中，煮沸不要超过 2 min，调节 pH至 pH 7.4 0.2。 DB15/T 1594 2019 5 A.3 营养琼脂 A.3.1 成分 蛋白胨 10.0 g 牛肉粉 3.0 g 氯化钠 5.0 g 琼脂 15.0 g A.3.2 制法 将上述成分加入到 1000 mL蒸馏水中，加热溶解，调节 pH至 7.3 0.1，分装后 121 高压灭菌 15 min。 A.4 马铃薯葡萄糖琼脂 A.4.1 成分 马铃薯 200.0 g 葡萄糖 20.0 g 琼脂 20.0 g A.4.2 制法 将上述成分加入到 1000 mL蒸馏水中，加热溶解，分装后 121 高压灭菌 15 min。 _
