1、 ICS 11.220 B 41 DB14 山西省地方标准 DB 14/ T 17892019 禽流感病毒H7亚型抗体竞争ELISA 检测方法 2019 - 06 - 25发布 2019 - 08 - 25实施 山西省市场监督管理局 发布 DB14/ T 17892019 I 目 次 前言 . II 1 范围 . 1 2 缩略语 . 1 3 实验原理 . 1 4 实验条件 . 1 5 实验方法 . 1 6 结果判定 . 2 7 注意事项 . 3 附录 A（规范性附录） 试剂配制方法 . 4 DB14/ T 17892019 II 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。
2、 本标准由山西省农业农村厅提出 并监督实施 。 本标准由山西省农业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：山西省动物疫病预防控制中心、武汉科前生物股份有限公司、华中农业大学。 本标准主要起草人：雷宇平、王仲兵、郎小兵、金梅林、董晓辉、但汉并、卢月、胡明明、王治维、 芦俊彦、樊慧锦、宁艳、雷冲、王锦、刘田勇。 DB14/ T 17892019 1 禽流感病毒H7亚型抗体竞争ELISA检测方法 1 范围 本标准规定了应用竞争酶联免疫吸附法检测血清中禽流感病毒 H7亚型抗体方法的缩略语、实验原 理、实验条件、实验方法、结果判定和注意事项。 本标准适用于禽流感病毒 H7亚型抗体的检测。 2 缩略语 下
3、列缩略语适用于本文件。 ELISA：酶联免疫吸附试验（ enzyme linked immunosorbent assay） OD：光密度值 (optical density) HRP：辣根过氧化物酶 (horseradish peroxidase) 3 实验原理 本标准采用竞争酶联免疫吸附法，该方法利用抗原抗体反应具有特异性的特点，将特异性的H7 亚型 禽流感病毒血凝抑制试验抗原吸附到固相载体的表面，将待检血清和特异性酶标单抗同时加入包被板 孔。由待检血清中的抗体和酶标单抗竞争与包被抗原结合，待检血清中抗体越多，结合在包被抗原上的 酶标单抗就越少，阳性血清反应呈色浅于阴性血清。 4 实验条件
4、 4.1 实验室环境 实验操作在 15 25 下进行。未灭活的感染性材料的实验活动，应在级生物安全柜内进行。 4.2 仪器 级生物安全柜、离心机、酶标仪、洗板机（或手洗）、微量移液器、冰箱、恒温箱。 5 实验方法 5.1 实验材料 禽流感病毒H7 亚型包被抗原、HRP 标记的禽流感病毒 H7亚型HA 蛋白的单克隆抗体（酶标记物）、底 物液、终止液、样品稀释液、洗涤液、包被液、封闭液。 试剂配制方法见附录 A。 5.2 样品准备 DB14/ T 17892019 2 取动物全血，待血液充分凝固后，4 000 r/min离心10 min ，收集血清。也可等凝固后自然析出血 清。血清应清亮，无溶血。
5、 样品处理过程中应防止样品的污染，注意个人安全防护。 5.3 包被 用包被液将包被抗原稀释至工作浓度 2 g/mL，加至抗原包被板中，每孔100 L ，放置 2 8 条件下，包被15 h。 5.4 封闭 弃去包被液，每孔加入封闭液200 L，置 37 1 孵育 2 h；弃去封闭液，拍干，再置37 1 干燥 2 h。 5.5 待检血清的稀释 待检血清在血清稀释板中做10倍稀释。 5.6 操作步骤 5.6.1 加样 取抗原包被板，先用洗涤液洗涤抗原包被板1 次，稀释好的待检血清、阴性对照和阳性对照各取50 L，加至抗原包被板中，每板待检血清设1孔，阴、阳性对照各设 2孔，同时加入酶标记物50 L
6、。轻 轻振匀孔中样品，置 37 1 下温育 45 min。 5.6.2 洗涤 弃去孔中液体，每孔加入洗涤液 200L，重复洗涤 5次，最后一次拍干。 5.6.3 加酶标抗体 将辣根过氧化物酶（ HRP）标记的抗体用封闭液 1:1000稀释，每孔加 100 L，37 1 放置 30 min。 5.6.4 洗涤 弃去孔中液体，每孔加入洗涤液 200L，重复洗涤 5次，最后一次拍干。 5.6.5 加底物液 每个反应孔加入底物液100L，置 20 25 下避光显色 15 min。 5.6.6 加终止液 每孔加终止液50 L ，10 min内在酶标仪上测定 450 nm波长处的OD 值。 6 结果判定
7、试验成立的条件：阴性对照的平均OD 450nm值大于 1.0，阳性对照的抑制率（PI 值）大于50% 。 S=样品孔 OD450nm值， N=阴性对照孔平均 OD450nm值。 PI值=(1 -S/N)100%。 DB14/ T 17892019 3 若被检样品的抑制率小于 40%，该样品判为禽流感病毒H7亚型抗体阴性。若被检样品的抑制率大于 或等于 40%，该样品判为禽流感病毒 H7亚型抗体阳性。 7 注意事项 7.1 人员防护 实验过程中注意做好个人的安全防护工作。 7.2 样品处理 血清应在级生物安全柜中析出。 7.3 废弃物处理 操作区应有专门的固体和液体废弃物收集容器。废弃物经高压灭
8、菌后按相关规定处理。 DB14/ T 17892019 4 A A 附 录 A （规范性附录） 试剂配制方法 A.1 包被液 包被液为碳酸盐缓冲液（0.025 mol/L ，pH 9.6）。将下列试剂按序加入 1 000 mL规格的容器中， 加800 mL蒸馏水充分溶解，定容至 1 000 mL。 碳酸钠（Na 2CO3） 1.59 g 碳酸氢钠（ NaHCO3） 2.93 g 加蒸馏水至 1 000 mL A.2 洗涤液 氯化钠（NaCl） 8.0 g 氯化钾（KCl ） 0.2 g 十二水磷酸氢二钠（ Na2HPO412H2O） 2.9 g 磷酸二氢钾（KH 2PO4） 0.2 g Twe
9、en-20 0.5 mL 加蒸馏水至 1 000 mL A.3 底物液 商品化 TMB显色液。 A.4 终止液 98%浓硫酸（ H2SO4） 108.8 mL 加蒸馏水至 1 000 mL A.5 样品稀释液 氯化钠（NaCl） 8.0 g 氯化钾（KCl ） 0.2 g 十二水磷酸氢二钠（ Na2HPO412H2O） 2.9 g 磷酸二氢钾（KH 2PO4） 0.2 g 加蒸馏水至 1 000 mL A.6 封闭液 牛血清白蛋白（ BSA） 5.0 g DB14/ T 17892019 5 氯化钠（NaCl） 8.0 g 氯化钾（KCl ） 0.2 g 十二水磷酸氢二钠（ Na2HPO412H2O） 2.9 g 磷酸二氢钾（KH 2PO4） 0.2 g 硫柳汞钠 0.2 g 加蒸馏水至 1 000 mL _
