1、 ICS 65.020.30 B 43 DB14 山西省地方标准 DB 14/ T 17752019 广灵驴冷冻精液 2019 - 06 - 25发布 2019 - 08 - 25实施 山西省市场监督管理局 发布 DB14/ T 17752019 I 目 次 前 言 . II 1 范围 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3 术语和定义 . 1 4 要求 . 2 5 抽样 . 2 6 质量检验 . 3 7 结果判定 . 3 8 包装及标识 . 4 附 录 A （规范性附录） 广灵驴冷冻精液质量检验方法 . 5 DB14/ T 17752019 II 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-200
2、9 给出的规则起草。 本标准由山西省农业 农村厅提出 并监督实施 。 本标准由山西省农业标准化技术委员会归口 。 本标准起草单位：山西省畜禽繁育工作站、广灵县优种驴场。 本标准主要起草人：明世清、孙永胜、李树军、贠红梅、刘莉、陈廷珠、赵小凤、张佳楠、李沁、 杨建军、弓瑞娟、张敏、张明娟、邢亚亮。 DB14/ T 17752019 1 广灵驴冷冻精液 1 范围 本标准规定了广灵驴冷冻精液要求、抽样、质量检验、结果判定和包装及标识。 本标准适用于广灵驴冷冻精液质量鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引
3、用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 2828.2-2008 计数抽样检验程序 第2 部分：按极限质量（ LQ）检索的孤立批检验抽样方案 GB/T 2828.11-2008 计数抽样检验程序 第11 部分：小总体声称质量水平的评定程序 GB 4143 牛冷冻精液 GB/T 5458 液氮生物容器 GB/T 25245 广灵驴 NY/T 1234 牛冷冻精液生产技术规程 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 直线前进运动精子数 每剂量精液中呈直线前进运动的精子数。 3.2 精子活力 在 37环境下直线前进运动精子占总精子数的百分率。 3.3 精子畸形率
4、畸形精子占总精子数的百分率。 3.4 细菌数 每剂量精液经培养后观察到的细菌菌落数。 DB14/ T 17752019 2 3.5 冷冻精液 将原精液过滤、离心后，用稀释液等温稀释、平衡后超低温快速冷冻，在液氮中（ -196）保存的 精液。 3.6 广灵驴 符合 GB25245 的品种特征要求。 4 要求 4.1 新鲜精液 从种用价值评价为特等或一等、体质健康、无遗传病的种用广灵驴中采集， 色泽乳白色或淡黄色。 精子活力 70%，精子密度 210 8 个 /mL，精子畸形率 14%。 4.2 每剂量解冻后精液 4.2.1 外观 细管无裂痕，两端封口严密 ，印制标志清晰，剂量充足。 4.2.2
5、剂型、剂量 细管冷冻精液， 中型，剂量 0.4 mL/ 支。 4.2.3 精子活力 精子活力 30%。 4.2.4 直线前进运动精子数 直线前进运动精子数 310 7 个。 4.2.5 精子畸形率 精子畸形率25% 。 4.2.6 细菌数 细菌数1000 个。 5 抽样 5.1 抽样检验方案 5.1.1 生产方抽样检验 按照 GB/T 2828.2-2008 中的第 4 章，采用 极限质量 LQ=20，模式一次抽样方案 ，确定抽样公驴 DB14/ T 17752019 3 样本量。 5.1.2 质量监督抽样检验 按照 GB/T 2828.11-2008 中的第 6 章，该群体广灵驴种公驴为一检
6、查总体，采用 DQL=10，选用第 检验水平 的抽样方案；查 GB/T 2828.11-2008 中表 B.2，确定抽样公驴的样本量 。 5.1.3 复检和仲裁抽样检验 复检可根据原抽样方案确定， 仲裁 应按照 5.1.2 规定的方案 进行抽样检验，按照 7.3.2 规定的方案进 行评定。 5.2 抽样方法 随机抽样。 6 质量检验 6.1 外观 用目测法，其结果应符合 4.2.1 的规定。 6.2 剂量 检验按 附录 A.2 的方法 ， 结果应符合 4.2.2 的规定。 6.3 解冻后每剂量精液 解冻方法及精子活力、直线前进运动精子数、精子畸形率、细菌数的检验按照附录 A.3A.6 规 定的
7、方法，其结果应分别符合 4.2.34.2.6 的规定。 6.4 检验项目 6.4.1 常规检验 对冻精的单项目检验是型式检验的一部分 ， 主要是在入库前和出库时的检验，结果符合本标准中 4.2.1 和 4.2.3 的 规定。 6.4.2 型式检验 对冻精全部项目检验，评定产品质量是否全面符合标准，也是在冷源异常、生产方抽样检验、仲裁 和质量监督抽样验验时选定项的检验，结果符合本标准中 4.2 的规定。 7 结果判定 7.1 常规检验 样品中任何一项目检验未达到 4.2.1 和 4.2.3 的规定 要求， 则判为不合格。 7.2 型式检验 样品中任何一项目检验未达到 4.2 的规定要求，则判为不
8、合格。 DB14/ T 17752019 4 7.3 抽样检验对群体质量水平的评定 7.3.1 生产方抽样检验 生产方抽样检验按照 GB/T 2828.2-2008 中第 4 章的规定，通过对 本样本检验，若样本中不合格品 数等于或小于接收数 AC，则接收该批（合格），否则不接收该批（不合格）。 7.3.2 质量监督抽样检验 按照 GB/T 2828.11-2008 中规定，在样本中 d（不合格品数） L （不合格品限定数) ，即抽检样本 符合要求，核查通过；当 dL, 即抽检样本不符合要求，核查总体不合格。 8 包装及标识 8.1 包装 灭菌纱布袋包装并设外标签， 每一包不得超过 100 剂
9、细管，保证装入细管冻精后能自然浸泡在液氮 中。 8.2 标识 在细管壁和纱布袋外标签上印制以下内容，印制标识清楚，并按以下顺序排列： 8.2.1 生产站（场）名； 8.2.2 广灵驴种公驴编号； 8.2.3 生产日期或批次； 8.2.4 冻精数量。 DB14/ T 17752019 5 A A 附 录 A （规范性附录） 广灵驴冷冻精液质量检验方法 A.1抽样 A.1.1样品的收集 抽样：从贮存冷冻精液的液氮容器中按规定随机抽取样品。 送样：将抽取的样品送至检测机构。 A.1.2抽样方案 A.1.2.1生产方抽样检验 按本标准 5.1.1 确定样本数。 A.1.2.2质量监督抽样检验 按本标准
10、 5.1.2 确定样本数。 A.1.2.3抽样方法 按驴号顺序排列，由抽样人员现场按样本头数随机确定各样品公驴。 A.1.2.4全部取样 对已投产的每头公驴取样。 A.1.3取样方法 对确定取样的公驴，从贮存冷冻精液的液氮容器中随机抽取不少于 25 剂的冻精。 A.1.4样品的保存 存放冷冻精液的液氮容器质量应符合 GB/T 5458 的规定， 使用前经过清洗后加入新鲜液氮， 样品浸 在液氮中。取放样品时在空中暴露时间不得超过 10 s。 由专人保管样品 ，样品不允许脱离液氮， 抽样登 记单与样品随行。样品包装、标记应保持原样。 A.2剂量检查 A.2.1主要器材 小试管、剪刀、刻度吸管。 A
11、.2.2检查方法 取三支细管冷冻精液自然解冻后剪去两端，把精液倒入一小试管内 ，用 1.5mL 吸管准确吸取精液 ， 并读取总精液量。 A.2.3计算 三支冻精的剂量平均数为样品的剂量，按式 (A.1)计算： Q= （ n1+n2+n3）/3 （A.1 ） 式中： Q剂量值 ，单位为毫升 (mL)； n1第一支样品剂量 ，单位为毫升(mL) ； n 2 第二支样品剂量 ，单位为毫升(mL) ； n3第三支样品剂量 ，单位为毫升(mL) 。 DB14/ T 17752019 6 A.3 精子活力检查 A.3.1 主要器材 显微镜或电视显微装置、恒温水浴箱、5.0 mL 试管、载玻片或精液性状板、
12、盖玻片（ 1818）、 显 微镜保温箱或恒温装置、滴管。 A.3.2 检查方法 三支细管分别直接置于 37水浴中解冻，取解冻三支混合后精液约 50 L 置于载玻片上加盖玻片， 立即在载物台温度保持 38的情况下用 200 倍400 倍显微镜观察活力，也可通过电视显微装置在荧光 屏上观察活力。每样片观察 3 个视野，并应观察不同液层内的精子运动状态，进行全面评定。 A.3.3 计算 三个视野活力评价值的平均数按式（ A.2）计算： M（ n1+n2+n3）/3 （ A.2） 式中： M活力 n1第一视野活力； n2第二视野活力； n3第三视野活力。 A.4 每剂量直线前进运动精子数检查 A.4.
13、1主要器材 血球计数板、血色素管、 1 mL 吸管、小试管、计数器、显微镜或电视显微装置、滴管、3.0%氯化 钠溶液。 A.4.2 检查方法 细管精液用血色素管准确吸取 20 L 解冻精液（也可使用第 A.2 章已检查后的样品），注入盛有 0.98 mL 的 3.0%氯化钠溶液的试管内，混匀，使之成为 50 倍稀释的稀释精液。将备好的血球计数板用血盖片 将计数室盖好，用小吸管吸取一滴稀释精液于血盖片边缘，使精液自行流入计数室，均匀充满，不允许 有气泡或厚度过大，然后在显微镜下或电视荧光屏上观察计数。 A.4.3 计数 a)每剂量中精子数 5 个中方格中的精子数 5（即计数室 25 个中方格的总
14、精子数） 10（1mm 3 内 的精子数） 1 000（每毫升精液的精子数） 50（细管稀释倍数） 剂量值 上式可简化为： 每剂量中精子数5 个中方格精子数 250 万（细管） 剂量值 b)每样品观察上下两个计数室，取平均值，如两个计数室计数结果误差超过 5%，则应重检。 c)每剂量中呈 直线前进运动精子数按式（A.3 ）计算： c=sm （A.3） 式中： c每剂量中前进运动精子数，单位为个； s每剂量中精子数，单位为个； m活力， %。 A.5 精子畸形率的检查 A.5.1 主要器材 显微镜、载玻片、血球分类计数器、小吸管、蒸馏水、姬姆萨染料、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、甲 DB14/ T 1
15、7752019 7 醛、甲醇、甘油，所有试剂为分析纯。 A.5.2 试剂配制 a)磷酸盐缓冲液 磷酸二氢钠（ NaH2PO42H2O） 0.55 g 磷酸氢二钠（Na 2HPO412H2O） 2.25 g 双蒸馏水定容至 100mL。 b) 中性福尔马林固定液 40%甲醛 HCHO（使用前经碳酸镁中和过滤） 8.0 mL 磷酸二氢钠（NaH 2PO42H2O） 0.55 g 磷酸氢二钠（Na 2HPO412H2O） 2.25 g 用 0.89%氯化钠约 50.0mL溶解后加入 8.0 mL中和后的甲醛，再加 0.89%氯化钠溶液定容至 100.0 mL。 c) 姬姆萨原液 姬姆萨染料 1.0
16、g 甘油 C 3H5(OH)3 66.0 mL 甲醇 （CH 3OH） 66.0 mL 姬姆萨染料放入研钵中加入少量甘油充分研磨至无颗粒为止，然后将甘油全部倒入并放入恒温箱中 保温继续溶解 4h，再加甲醇充分溶解混匀，过滤后贮于棕色瓶中待用，贮存时间越久染色效果越好。 d) 姬姆萨染液 姬姆萨原液 2.0 mL 磷酸盐缓冲液 3.0 mL 蒸馏水 5.0 mL 现配现用。 A.5.3 制片、染色、镜检、计算 精液解冻见 A.3 允许同时使用精子活力检查解冻的样品。 a)抹片：取解冻后精液一滴滴于载玻片一端，用另一边缘光滑的载玻片与有样品的载玻片呈 35 夹角，将样品均匀地拖布于载玻片上，自然风
17、干（约 5 min），每样品制作两个抹片。 b)固定：在已风干的抹片上滴上 1.0mL2.0 mL 中性福尔马林固定液，固定 15 min 后用清水缓缓 冲去固定液，吹干或自然风干。 c)染色：将固定好后的抹片反扣在带有平槽并使抹片接触染色 1.5 h 后用清水缓缓冲去染液，晾干 待检。 d)镜检：将制备好的抹片在显微镜（ 400 倍600 倍）下观察，每个抹片观察 200 个以上的精子（分 左、右两个区），取两片的变异系数不得大于 20%，若超过应重新制片。 e)精子畸形率按式（ A.4）计算： AA1/S 100 （ A.4） 式中： A精子畸形率，% ； A1畸形精子数，单位为个； S精
18、子 总数，单位为个。 A.6细菌数的检查 A.6.1 主要器材 培养箱、超净化工作台、三角烧瓶、量筒、玻棒、天平、牛角匙、高压蒸汽灭菌锅（或微波炉）、 培养皿、水浴箱、PH 试纸（ pH5.59.0 ）、棉花、牛皮纸、记号笔、棉绳、纱布、放大镜、牛肉浸膏、 DB14/ T 17752019 8 蛋白胨、磷酸氢二钾、氯化钠、琼脂粉、 1 mol/L 氢氧化钠、盐酸、蒸馏水。 A.6.2培养基的配制 普通琼脂的制作： 牛肉浸膏 5.0 g 蛋白胨 10.0 g 磷酸氢二钾（ K2HPO43H2O） 1.0 g 氯化钠（NaC1） 5.0 g 用蒸馏水 1 000 mL 溶解后加琼脂粉 20g ，加
19、温融解。 矫正 pH 至 7.47.6 并用脱脂棉过滤，分装于三角烧瓶中经高压灭菌（ 0.1 MPa, 20 min）。 也可使用营养琼脂培养基，其质量应符合 GB/T 4789。 A.6.3检查方法 灭菌平皿事先标号。细管冻精 37水浴解冻，用酒精棉球消毒以无菌操作，一支直接注于一个灭 菌皿内；把已凉至 50 左右的普通琼脂以无菌操作倾倒入平皿内，每皿约 15 mL，并转动平皿使精液 混合均匀，同时做空白对照平皿。待琼脂凝固后翻转平皿，置 37 恒箱内培养 48 h 取出，计数平皿 内菌落数。每头公驴样品取两支做两个平皿，取平均值。 A.6.4计算 所检细管样品的细菌数按式（A.5 ）计算： A（ n1+n2） /2 N 0 （A.5） 式中： B 细菌数，单位为个； N0空白对照平皿菌落数，单位为个； n1第一平皿菌落数，单位为个； n2第二平皿菌落数，单 位为个。 _
