1、ICS 65.020.30 B 43 DB14 山西省 地方标准 DB 14/ T 1518 2017 晋汾白猪种质分子鉴定 SSR标记法 2017 - 12 - 10发布 2018 - 02 - 10实施 山西省质量技术监督局 发布 DB14/ T 1518 2017 目 次 前言 . II 1 范围 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3 术语和定义 . 1 4 原理 . 2 5 试验准备 . 2 6 步骤 . 2 7 判定依据 . 3 8 结果表述 . 3 附录 A（规范性附录） 溶液配制说明 . 4 附录 B（资料性附录） FAO-ISAG 推荐 引物信息表 . 7 附录 C（资料性附
2、录） 样品 DNA 的制备及质控检测 . 8 附录 D（资料性附录） PCR 反应体系及程序 . 10 附录 E（资料性附录） 扩增产物的银染检 测方法 . 11 附录 F（资料性附录） 数据分析指标及公式 . 13 DB14/ T 1518 2017 II 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009给出的规则 起草 。 本标准由山西农业大学提出并归口。 本标准起草单位：山西农业大学、中国农业大学、大同市种猪场、山西省畜禽繁育工作站、山西天 合元动物保健科技有限公司。 本标准主要起草人：高鹏飞、郭晓红、曹果清、 李步高 、刘剑锋、杨连仲、 王效京 、刘宏、孙秉耀、 石建中、赵万军。 DB1
3、4/ T 1518 2017 1 晋汾白猪种质分子鉴定 SSR 标记法 1 范围 本标准规定了利用 SSR标记法进行晋汾白猪品种鉴定的原理、试验准备、步骤、判定 依据 和结果表 述。 本标准适用于晋汾白猪种质分子鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 19495.2 转基因产品检测 实验室技术要求 NY/T 1673 畜禽微卫星 DNA遗传多样性检测技术规程 SN/T 2123 出入境动物检疫实验样品采集、运输和保存规范。 DB14/T
4、1300 晋 汾白猪 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 SSR标记 SSR标记，即简单重复序列（Simple Sequence Repeats, SSR），又称微卫星 DNA，由核心序列和两 侧的侧翼序列组成，侧翼序列使微卫星特异地定位于染色体上，核心序列重复数的差异形成微卫星高度 的多态性。 3.2 参照样品 对应于 SSR位点不同等位基因的一组样品。 3.3 位点 对应于 SSR位点不同 等位基因的一组样 品。 3.4 核心位点 DB14/ T 1518 2017 2 DNA分子标记法鉴定品种时优先选用的一组位点，具有多态性高、稳定性强、重复性好、分布均匀 等特点。 3
5、.5 扩展位点 DNA分子标记法鉴定品种时备选的一组位点，具有重复性好，分布均匀的特点 。 4 原理 根据 SSR侧翼序列设计一对特异引物，利用 PCR技术扩增目的片段，由于不同个体 SSR重复数不等， 电泳后不同长度的 PCR产物得以分离，经硝酸银染色加以区分。 5 试验准备 5.1 实验仪器设备 凝胶成像系统、 PCR仪、低温高速离心机、紫外分光光度计、稳压温流电泳仪、高压灭菌器、单道 可调移 液器 (2 l， 10 l， 20 l， 100 l， 200 l， 1000 l)、微量电子天平、水浴恒温震荡器、电 泳槽、普通离心机、紫外检测仪、超纯水仪。 5.2 试验所用试剂 血液裂解液、组
6、织 DNA提取液和精子裂解液、饱和酚、三氯甲烷、异戊醇、无水乙醇、溴化乙锭、 10TBE或 TAE电泳缓冲液、 6上样缓冲液、 100 bp DNA分子量标记、冰乙酸、琼脂糖、 RNA酶、蛋白酶 K、 丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、过硫酸铵、硝酸银、 N,N,N,N-四甲基乙二胺（ TEMED）、无水碳酸钠、 dNTPs、 Tap DNA聚合 酶、超纯水。 5.3 溶液配置 溶液配置方法见附录 A， 除另外说明外， 附录 A中 仅使用确认为分析纯的试剂。 6 步骤 6.1 样品采集 6.1.1 对于动物样品的采集与保存按照 SN/T 2123 的规定 执行。 6.1.2 采集个体应具备晋汾白猪品种
7、的典型特征 ，符合 DB14/T 1300 的要求，采集三代内无血缘关系 的个体不少于 30 头，其中雌性数量不少于 1/3。 6.1.3 样品采集时 应 详细记录材料名称、来源、系谱、采集地点和时间、样品保存条件。 6.2 样品 DNA提取 样品 DNA的制备方法 参 见附录 B。 6.3 引物合成 DB14/ T 1518 2017 3 使用联合国粮农组织 (FAO)和国际动物遗传学会 (ISAG)推荐的用于畜禽微卫星 DNA遗传检测的标记 30对，引物序列 参 见附录 C。引物合成委托 生物 公司合成。 6.4 DNA微卫星位点的扩增及检测 6.4.1 采用 PCR 方法扩增所选微卫星引
8、物的目的片段。 6.4.2 PCR 反应体系及程序 参 见附录 D。 6.4.3 扩增产物的检测方法 参 见附录 E。 6.5 基因分型 6.5.1 利用凝胶成像分析系统进行分析，根据分子量标记物的大小标定检测片段的大小。 6.5.2 扩增片段要求条带清晰；纯合子为一条带，杂合子为两条带，且两条带着色深浅基本一致。 6.5.3 根据片段大小确定等位基因型。 6.6 数据统计分析 6.6.1 数据统计分析等位基因频率、哈代 -温伯格平衡、遗传杂合度、多态信息含量、基 因分化系数、 Nei 氏遗传距离，具体算法公式 参 见附录 F。 6.6.2 应用 GENEPOP 软件进行数据分析并进行聚类分析
9、，采用 Bootstrap 检验可检验所得系统发生树 的可靠性。 7 判定依据 7.1 品种间差异位点数 3，判定为不同品种。 7.2 品种间差异位点数 =2 或 1，判定为近似品种。 7.3 品种间差异位点数 =0，判定为疑同品种。 7.4 对 7.1 和 7.2 的结果，结合表型检测数据进行综合判定。 8 结果表述 检测位点数为 ，差异位点数为 ，判定为遗传相似度为 ，位点缺失率为 ，判定为 （相同或相近、不同）。 DB14/ T 1518 2017 4 附 录 A （规范性附录） 溶液配制说明 A.1 DNA提取试剂的配制 A.1.1 血液裂解液 血液裂解液配制见表 A.1。 表 A.1
10、 血液裂解液的配制 贮存液浓度 体积 (mL) 使用浓度 1 mol/L Tris-HCL（ pH8.0） 1 10 mmol/L 0.5 mol/L EDTA（ pH8.0） 20 100 mmol/L 10 %SDS 20 2% 灭菌双蒸水加至 100 A.1.2 组织 DNA提取液 组织 DNA提取液配制见表 A.2。 表 A.2 组织 DNA 提取液的配制 贮存液浓度 体积（ mL） 使用浓度 1 mol/L Tris-HCL（ pH8.0） 5 50 mmol/L 0.5 mol/L EDTA（ pH8.0） 20 100 mmol/L 0.5 mol/L NaCl 20 100 m
11、mol/L 10 %SDS 20 2 % 灭菌双蒸水加至 100 A.1.3 精子裂解液 精子裂解液配制见表 A.3。 表 A.3 精子裂解液的配制 贮存液浓度 体积 (mL) 使用浓度 1 mol/L Tris-HCL（ pH8.0） 1 10 mmol/L 0.5 mol/L EDTA（ pH8.0） 2 10 mmol/L 0.5 mol/L NaCl 20 100 mmol/L 10 %SDS 20 2 % 1 mol/L DDT （现用现加） 0.0039 39 mol/L 灭菌双蒸水加至 100 A.1.4 精子洗涤液 DB14/ T 1518 2017 5 取1 mol/L Na
12、Cl 37.5 mL， 0.5 mol/L的 EDTA 5 mL，加双蒸水至 250 mL。高 压灭菌备用。 A.1.5 0.5mol LEDTA溶液 1.86.1 g EDTA-Na2 2H2O溶于 800 ml水中，用 1 mol L NaOH调 PH至 8.0，定容至 1 000 mL，在 103.4 kPa灭菌。 A.1.6 1 mol L Tris-HCL溶液 60.55 g Tris-base溶于适量水中，加 1 mol L HCL调 PH至 8.0，定容至500 mL， 103.4 kPa灭菌。 A.1.7 0.5 mol L HCL溶液 25 mL浓盐酸（36 % 38 %），
13、加水定容至 500 mL。 A.1.8 氯仿 -异戊醇（24:1 ） 按24:1 的比例（体积比）配制混合液。 A.1.9 TE缓冲液 1 mol L Tris-HCL 5 mL， 0.5 mol L EDTA 1 mL，加 HCL调pH 至 8.0，定容至 500 mL。 A.1.10 蛋白酶K 贮存液（ 20 mg/mL） 200 mg蛋白 酶K 溶于 10 mL灭菌双蒸水中，分装，每管1 mL ,-20 冻存。 A.2 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂的配制 A.2.1 30 %丙烯酰胺（丙烯酰胺：甲叉双丙烯酰胺 =29： 1） 200 mL水中 溶解 285 g丙烯酰胺， 15 g甲叉双丙烯
14、酰胺，定容至 1 L， 4 保存。 A.2.2 6 % PAGE胶 尿素450 g ， 10 xBTE缓冲液100 mL， 40%PAGE胶 150 mL，定容至 1 000 mL。 A.2.3 10%过 硫酸铵溶液 8 mL水中溶解 1 g过硫酸铵，加水至 10 mL 4 保存 。 A.2.4 10 xTBE缓冲液 Tris-base 108 g，硼酸 55 g， EDTA-Na2 2H2O 7.44 g，定容至1 L。 A.2.5 1xTBE缓冲液 10 xTBE缓冲液500 m L，定容至5 L。 A.2.6 6x加样缓冲液 去离子甲酰胺（用于 DNA变形）49 mL， 0.5 mmol
15、 L EDTA 1 mL，溴酚蓝 0.125 g，二甲苯青 0.125 g。 A.3 银染试剂的配制 DB14/ T 1518 2017 6 A.3.1 固定液 200 mL冰醋酸，加水定容至 2 000 mL。 A.3.2 染色液 3 g硝酸银，加水定容至 2 000 mL。 A.3.3 显影液 2 000 mL，蒸馏水中加入 25 g氢氧化钠和 7 mL甲醛。 注： 银染溶液的配制可使用符合 GB T 6682规定的三级水。 DB14/ T 1518 2017 7 A B 附 录 B （资料性附录） FAO-ISAG 推荐引物信息表 B.1 DNA样品的制备方法 B.1.1 血液 DNA的
16、制备 B.1.1.1 取适量血液加入等体积血液样品裂解液，加入 RNA酶至终浓度为 20 g/mL，充分混匀， 37 消化 2 h。 B.1.1.2 加入蛋白酶 K至终浓度 100 g/mL，混匀， 55 水浴消化12 h。 B.1.1.3 加入等体积 Tris饱和酚，反复颠倒混匀， 4 12 000 r/min离心 15 min；吸取上清液转移至 另一离心管中。 B.1.1.4 加入等体积苯酚：氯仿那个：异戊醇（25 ： 24： 1）混合液，缓慢颠倒离心管使溶液充分混匀， 4 12 000 r/min离心 15 min，吸取上清液至另一离心管中。 B.1.1.5 加入 2.5倍体积的预冷无水
17、乙醇，轻轻颠倒离心管至白色絮状物 DNA沉淀出现，冰浴 20 min， 4 12 000 r/min离心 15 min。 B.1.1.6 弃去上清液，加入 75 %乙醇 1 mL洗涤沉淀。 B.1.1.7 等待 DNA干燥后，加入适量 TE缓冲液溶解。 B.1.2 组织 DNA的制备 B.1.2.1 取 0.1 g左右组织于 1.5 mL离心管中，用眼科手术剪剪碎。 B.1.2.2 加入 500 L组织 DNA提取 液，同 时加入 RNA酶至终浓度为 20 g/mL充分 混匀， 37 消化 2 h。 B.1.2.3 加入蛋白酶 K至终浓度 150 g/mL，混匀， 55 水浴消化12 h。 B
18、.1.2.4 以下步骤同 A.1.1.3 A.1.1.7。 B.1.3 毛发 DNA的提取 B.1.3.1 用灭菌水洗涤毛发，置于 1.5 mL离心 管中，剪碎。 B.1.3.2 加入 50 L组织 DNA裂解液，同时加入 RNA酶至终浓度为 20 g/mL充分混匀， 37 消化至毛发 完全溶解。 B.1.3.3 以下步骤同 A.1.1.2 A.1.1.7。 B.1.4 精液 DNA的提取 B.1.4.1 取冻精 2支或新鲜精液 0.5 mL，置于1.5 mL离心管中。 B.1.4.2 加入等量精液洗涤液， 4 500 r/min离心 6 min，弃去上清液，重复洗涤 2次。 B.1.4.3
19、加入 0.5 mL精子 裂解液，重悬沉淀。 B.1.4.4 以下步骤同 A.1.1.2 A.1.1.7。 B.2 DNA质控检测 B.2.1.1 配置 1 %琼脂糖凝胶，取 2 LDNA，进行电泳检测， DNA条带必须整齐，无拖尾。 B.2.1.2 取 2 L DNA样品，用 ND1 000分光光度计测定DNA 浓度 ， DNA的 A260/A280比值在1.8 2.0内，方可 用于后续检测。 DB14/ T 1518 2017 8 B C 附 录 C （资料性附录） 样品 DNA 的制备及质控检测 核心点 DNA的制备及质控检测见表 C.1。 表 C.1 核心位点引物信息表 序号 微卫星位点
20、 染色体 序列 (5to3) 退货温度 等位基因范围 1 S0002 3 GAAGCCCAAAGAGACAACTGC GTTCTTTACCCACTGAGCCA 56 186 216 2 S0005 5 TCCTTCCCTCCTGGTAACTA GCACTTCCTGATTCTGGGTA 56 203 267 3 S0026 16 AACCTTCCCTTCCCAATCAC CACAGACTGCTTTTTACTCC 56 87 105 4 S0068 13 CCTTCAACCTTTGAGCAAGAAC AGTGGTCTCTCTCCCTCTTGCT 56 211 262 5 S0090 12 CCAA
21、GACTGCCTTGTAGGTGAATA GCTATCAAGTATTGTACCATTAGG 56 227 249 6 S0097 4 GACCTATCTAATGTCATTATAGT TTCCTCCTAGAGTTGACAAACTT 56 209 250 7 S0101 7 GAATGCAAAGAGTTCAGTGTAGG GTCTCCCTCACACTTACCGCAG 58 197 221 8 S0143 12 ACTCACAGCTTGTCCTGGGTGT CAGTCAGCAGGCTGACAAAAAC 55 150 167 9 S0155 1 TGTTCTCTGTTTCTCCTCTGTTTG AAA
22、GTGGAAAGAGTCAATGGCTAT 56 142 162 10 S0178 8 TAGCCTGGGAACCTCCACACGCTG GGCACCAGGAATCAGCAATCCAGT 56 101 128 11 S0218 x GTGTAGGCTGGCGGTTGT CCCTGAAACCTAAAGCAAAG 56 158 205 12 S0226 2 GCACTTTTAACTTTCATGATACTCC AGAAATTAGTGCCTCAAATTGG 56 180 210 13 S0228 6 GGAATAGGCTGGCAGCAACA AGCCCACCTCATCTTATCTACACT 56 22
23、0 246 DB14/ T 1518 2017 9 表 C.1（续） 序号 微卫星位点 染色体 序列 (5to3) 退货温度 等位基因范围 14 S0355 15 TCTGGCTCCTACACTCCTTCTTGATG TTGGGTGGGTGCTGAAAAATAGGA 60 244 271 15 SW1067 6 TGCTGGCCAGTGACTCTG CCGGGGGATTAAACAAAAAG 58 136 176 16 SW122 6 TTGTCTTTTTATTTTGCTTTTGG CAAAAAAGGCAAAAGATTGACA 56 106 128 17 SW1828 1 AATGCATTGTC
24、TTCATTCAACC TTAACCGGGGCACTTGTG 60 82 110 18 SW1941 13 AGAAAGCAATTTGATTTGCATAATC ACAAGGACCTACTGTATAGCACAGG 56 202 224 19 SW2008 11 CAGGCCAGAGTAGCGTGC CAGTCCTCCCAAAAATAACATG 56 95 108 20 SW24 17 CTTTGGGTGGAGTGTGTGC ATCCAAATGCTGCAAGCG 56 95 124 21 SW240 2 AGAAATTAGTGCCTCAAATTGG AAACCATTAAGTCCCTAGCAAA 5
25、6 92 124 22 SW2406 6 AATGTCACCTTTAAGACTTGGG AATGCGAAACTCCTGAATTAGC 56 222 262 23 SW2410 8 AATTGCCCCCAAGGTATTTC CAGGGTGTGGAGGGTAGAAG 56 90 131 24 SW632 7 TGGGTTGAAAGATTTCCCAA GGAGTCAGTACTTTGGCTTGA 56 148 178 25 SW72 3 ATCAGAACAGTGCGCCGT TTTGAAAATGGGGTGTTTCC 56 97 114 26 SW830 10 AAGTACCATGGAGAGGGAAAT
26、G ACATGGTTCCAAAGACCTGTG 56 168 203 27 SW857 14 TGAGAGGTCAGTTACAGAAGACC GATCCTCCTCCAAATCCCAT 56 141 159 28 SW911 9 CTCAGTTCTTTGGGACTGAACC CATCTGTGGAAAAAAAAAGCC 56 149 173 29 SW936 15 TCTGGAGCTAGCATAAGTGCC GTGCAAGTACACATGCAGGG 56 90 116 30 IGF1 5 GCTTGGATGGACCATGTTG CATATTTTTCTGCATAACTTGAACCT 60 193 2
27、09 DB14/ T 1518 2017 10 C D 附 录 D （资料性附录） PCR 反应体系及程序 D.1 PCR反应体系 在冰上按照表 D.1所列成分和用量，顺序依次加入 PCR管，准备反应体系。 表 D.1 PCR 反应体系（单样品，单引物，25L ） 成分 用量 / L ddH2O 16.0 10PCR buffer 2.5 dNTPs（ 2.5 mmol/L/种） 2.0 Upprimer（ 10 mmol/L） 1.0 Lowprimer（ 10 mmol/L） 1.0 DNA（ 50 ng/ L） 2.0 Taq DNA 聚合酶（ 2.5 U/ L） 0.5 总体积 25.
28、0 D.2 反应程序 按表 D.2程序设置 PCR反应流程。 表 D.2 PCR 反应程序 反应程序 时间 94 预变性 5 min 94 变性 0.5 min 55 退火 0.5 min 72 延伸 0.5 min 循环 35 次 72 延伸 5 min 4 终止反应 DB14/ T 1518 2017 11 D E 附 录 E （资料性附录） 扩增产物的银染检测方法 E.1 灌胶板制作 玻璃板洗净，用蒸馏水冲洗并擦干，充分晾干。 E.1.1 组装玻璃板 待玻璃板彻底干燥后组装电泳板，并调平。 E.1.2 灌胶 在50 m l6% PAGE胶中加入 TEMED 65 l和 10%的过硫酸铵
29、250 l，迅速混匀后灌胶，上部插入梳子， 室温凝聚 1 h。 E.1.3 预电泳 正极槽（下槽）中加入 1TBE缓冲液600 mL，在负极槽（上槽）中加入0.5 TBE缓冲液600 mL，拔 出梳子， 80 W恒功率预电泳 30 min。 E.1.4 样品制备 10 lPCR扩增样品加入 3 l 6 加样缓冲液，混 匀后，在94 变性 10 min，迅速用冰水浴冷却。 E.1.5 电泳 移液枪吸取样品 DNA混合液 4 l， 70 W恒功率电泳 50 min，电泳结束，分离玻璃板，取下凝胶。 E.2 银染 E.2.1 固定 将凝胶板置于装有固定液的塑料盒内，轻轻摇荡 10 min。 E.2.
30、2 漂 洗 双蒸水漂洗 3 min。 E.2.3 染色 在新配染色液中，轻轻摇荡 20 min。 E.2.4 漂洗 双蒸水漂洗，时间不超过 10 s。 E.2.5 显影 在显影液中。轻轻摇荡，直至出现带纹。 DB14/ T 1518 2017 12 E.2.6 定影 在固定液中定影 2 min。 E.2.7 漂洗 用 1.5 L双蒸水 漂洗2 min。 E.2.8 干胶 室温下自然晾干。 DB14/ T 1518 2017 13 E F 附 录 F （资料 性附录） 数据分析指标及公式 F.1 等位基因频率 ip 等位基因频率 ip 按公式 (F.1)计算： ii HPp 21 . (F.1)
31、 式中： ip 某一等位基因的频率； P 含有某一等位基因的纯合子的频率； iH 含有某一等位基因的杂合子的频率。 F.2 哈代- 温伯格平衡检验 哈代- 温伯格平衡检验按 照公式计算： n i i ii EEOx 1 2 2 5.0 (F.2) 式中： iO 基因型 i 的观察频数； iE 基因型 i 的理论频数； n 为基因型的数目。 自由度 df=1 F.3 遗传杂合度和平均遗传杂合度 F.3.1 遗传杂合度 h 按公式 (F.3)计算 。 当一个标记位点的 m 个等位基因的频率分别为 1P 2P mP 时， DB14/ T 1518 2017 14 m i iPh 1 21 (F.3)
32、 F.3.2 平均遗传杂合度 H 按公式 (F.4)计算 。 r j j rhH 1 / (F.4) 式中： r 检测的座位数； iP 第 r 个座位第 i 个等位基因的频率； jh 第 j 座位的遗传杂合度。 F.4 多态信息含量的计算与判定 F.4.1 多态信息含量 PIC 按公式 (F.5)计算 。 11 1 221 2 21 mi mij jimi i pppP IC (F.5) 式中： ip 第 i 个等位基因的频率； jp 第 j 个等位基因的频率； m 该座位的等位基因数。 F.4.2 多态信息量的判定 。 一般来说，当 PIC 0.5时，该 座位为高度多态； 0.5PIC 0.
33、25时，为中度多态； PIC 0.25时，为 低度多态。 F.5 基因分化系数 基因分化系数 STG 按公式 (F.6)计算： TSTST HHHG (F.6) 其中： DB14/ T 1518 2017 15 nqH imj ijniS 211 1 mj jT rH 1 21 式中： n 所测群体的畜禽个体总数； ijq 第 i 个群体在某标记位点上第 j 个等位基因的频率； m 该座位的等位基因数； im 第 i 个群体在该座位上的等位基因数； jr 该座位上第 j 个等位基因在总群体中的平均频率。 多座位时，平均基因分化系数是所有座位的基因分化系数的算术平均值。 F.6 Nei 氏标准遗
34、传距离 SD Nei 氏标准遗传距离 SD sD 按公式(F .7)计算： ILnDS (F.7) 其中： 21yxxy JJJI ， rj mi ijx j rXJ 1 1 2 ， rj mi ijy j rYJ 1 1 2 ， rj mi ijijxy j rYXJ 1 1 ， 式中： ijX X 群体中第 j 个座位上第 i 个等位基因的频率； ijY Y 群体中第 j 个座位上第 i 个等位基因的频率； jm 第 j 个座位上的等位基因数； DB14/ T 1518 2017 16 r 检测的座位数。 F.7 Nei i 氏遗传距离 AD Nei 氏遗传距离 AD 按公式 (F.8)计算 。 r j m i ijijA j yx rD 1 111 (F.8) 式中： ijX X 群体中第 j 个座位上第 i 个等位基因的频率； ijY Y 群体中第 j 个座位上第 i 个等位基因的频率； jm 第 j 个座位上的等位基因数； r 检测的座位数。
