1、ICS 65.020.20 B 05 DB14 山西省 地方标准 DB 14/ T 1515 2017 食用百合脱毒试管苗繁育技术规程 2017 - 12 - 10发布 2018 - 02 - 10实施 山西省质量技术监督局 发布 DB14/ T 1515 2017 I 目 次 前言 . II 1 范围 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3 术语和定义 . 1 4 生产设施和仪器设备 . 2 5 培养基 . 2 6 环境消毒和无菌操作 . 2 7 脱毒母株的获取 . 3 8 脱毒试管苗鳞茎的诱导和增殖 . 3 9 脱毒试管鳞茎生根 . 4 10 脱毒试管鳞茎的移栽 . 4 DB14/ T 1
2、515 2017 II 前 言 本标准按照 BG/T 1.1-2009给出的规则 起草 。 本标准由山西农业大学提出并归口。 本标准起草单位：山西农业大学。 本标准主要起草人：赵娟、温银元、尹美强、张彬、王计平、宋喜娥、董淑琦、原向阳、王玉国、 郭平毅。 DB14/ T 1515 2017 1 食用百合脱毒试管苗繁育技术规程 1 范围 本标准规定了 食用 百合脱毒试管苗（鳞茎）繁育的生产设施和仪器设备、培养基、环境消毒和无菌 操作、脱毒母株的获取、脱毒试管苗鳞茎的诱导和增殖、脱毒试管鳞茎生根及脱毒试管鳞茎的移栽。 本标准适用于食用 百合脱毒试管苗的繁育。 2 规范性引 用文件 下列文件对于本文
3、件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 NY/T 1491 花卉植物病毒检测规程 NY/T 1744 切花百合脱毒种球 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 脱毒试管苗 在无菌条件下，应用茎尖组织培养技术获得，不带 LSV（百合无症病毒 ）、 CMV（黄瓜花叶病毒） 、 LMoV（百合斑驳病毒）病毒的 ， 在封闭容器内繁殖的种苗 。 3.2 鳞片 着生在鳞茎盘上的叶基或者叶鞘膨大而成的变态 叶。 3.3 鳞茎 在短缩茎盘省着生的肉质叶鞘膨大而成的变态器官。 3.4 脱毒试管鳞
4、茎 无菌条件下，在封闭培育容器内由脱毒试管苗诱导形成的鳞茎。 3.5 DB14/ T 1515 2017 2 籽球 通过组培苗或鳞片繁殖形成的周长小于 3 cm 的小鳞茎。 4 生产设施 和 仪器设备 4.1 生产设施 准备 室、 无 菌室、培养室、检测室 、温室等 。 4.2 主要仪器设备 超净工作台、压力蒸汽灭菌锅、鼓风干燥箱 、 光照培养箱、人工气候箱、冰箱体式显微镜（双筒 解剖镜）、空调、照度计、自动控时器、温湿度计 、 酶标仪、高速冷冻离心机、电泳仪、电泳槽、 PCR 仪、微量移液器 、 电子天平、 pH计、磁力搅拌器、电冰箱、移液枪、各种培养容器等。 5 培养基 选用 MS培养基（
5、 Murashige Skoog(1962)）为基本培养基。 5.1 MS培养基 母液 的配制 按 MS培养基 标准成分 配 制 。配 制 母液时，大量元素、微量元素、铁盐各成分依次加热溶解后混合， 冷却后定容，铁盐需装入棕色试剂瓶。各母液配制好后均放置在冰箱中 4 条件下保存 ， 使用时根据培 养基配 制 量取适量母液。 5.2 植物生长调节剂母液的配 制 植物生长调节剂配制成浓度为 0.5 mg/mL1 mg/mL的母液。配制时，先用 1 mL 2 mL95%乙醇溶解 （溶解 IBA、 NAA）或 0.1 mol/L的 HCl（溶解6- BA、 KT）溶解，再用无菌蒸馏水定容至所需浓度，摇
6、匀后 贮于棕色试剂瓶中，置于 4 冰箱中保存。 5.3 培养基的制备 配制时，先将培养基基本成分（大量元素、微量元素、铁盐、有机物）按照需要量加入量筒中，再 分别加入不同浓度需用量的各种激素，定容后加入糖和琼脂，放入蒸煮锅内煮开，用 0.1 mol/L的 HCl 或 NaOH调节 pH值至 5.65.8 ，分装于试管或三角瓶 等容器 中，用封口膜（盖）封口，放入高压蒸汽灭菌 锅中进行灭菌。灭菌时工作压力稳定在 1.1 kg/cm2（ 0.105 MPa），温度为 121 ，灭菌时间 20 min。 灭菌后置于试管架或存放架上冷却待用。 6 环境消毒和无菌操作 6.1 环境 消毒 接种前，提前
7、30 min开启无菌室室内和超净工作台紫外灯照射消毒，关灯后 15 min 20 min工作人 员方可进入室内操作。室内若有浮 尘 ，可用75%乙醇或 1%苯扎溴铵溶液（新洁儿灭消毒液）喷雾降尘。 每天工作结束后，清扫地面，可用有效氯含量 5% 6%的 次氯酸钠（ NaClO） 溶液（ 84消毒液） 500 mg/L 1 000 mg/L， 或将 27 g/L 33 g/L苯扎溴铵溶液稀释 10倍，或用 50%多菌灵 400倍液等交替进行地面消毒。 DB14/ T 1515 2017 3 接种服、工作帽、口罩、拖鞋等在消毒柜中消毒或用紫外灯照射消毒。操作所用的镊子、解剖刀、 解剖针、培养皿等均
8、需用纱布或牛皮纸包裹后，经过高压蒸汽灭菌，培养皿及滤纸可用牛皮纸包好置于 鼓风干燥箱内 200 下灭 菌 2 h。 6.2 无菌操作 工作人员进入接种室前，需用肥皂清洗手臂，在更衣室穿好消毒过的接种服、工作帽、口罩和拖鞋 （鞋套）。操作时用 75%乙醇 仔细擦拭双 手 、超净工作台台面。将镊子、接种刀等接种工具浸泡在 95% 乙醇中，使用前，在酒精灯外焰上灼烧灭菌后（也可用 消毒器代替酒精灯），置于搁置架上冷却待用， 在操作中接种工具要重复进行灭菌。 7 脱毒母株的获取 7.1 外植体 选择外观无病毒症状的植株，以其饱满、无 病虫害、无损伤的健康鳞茎为脱毒培养材料，取中心 茎尖为外植体。 7.
9、2 鳞茎灭菌 用自来水冲洗鳞茎表面泥土，剥离鳞茎外层鳞片，以周长小于 1 cm的鳞茎为外植体，放入烧杯中， 移至超净工作台上，先用 75%乙醇（酒精）浸泡 10 s 30 s，再用10 % NaClO灭菌处理 12 min，之后用无 菌水冲洗 4 5次，再用无菌滤纸吸去表面水分，置于无菌培养皿中备用。 7.3 茎尖剥离 将灭过菌 的鳞茎置于 40 倍体式显微镜（双筒显微镜）下，用解剖针由外向内剥去鳞片，直至露出 光滑的茎尖，用解剖刀切取 0.5 mm1 mm 的茎尖，接种于 MS+6-BA 0.5 mg/L 1.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L+3%蔗糖培养基中，封口后，在培养瓶壁上标注
10、编号、接种日期等。 7.4 茎尖培养 把接种后的培养瓶放在培养室内的光照培养架上进行培养。培养条件为温度 (252) ，光照强度 2 000 Lx 3 000 Lx，光照时间 14 h 16 h/d。培养 30 40 d后，可看到茎尖明显伸长且呈绿色，继 续培养 诱导茎尖萌动成苗。 7.5 试管苗病毒检测 随机挑选 100份百合茎尖脱毒苗， 分别用DAS -ELISA或者 TR-PCR法对其进行 LSV、 CMV和 LMoV三种病毒 的检测，按照 NY/T 1744-2009中 的 5.1、 5.2、6.1、 6.2和6.3的规定 执行，筛选出无病毒的试管苗 。 8 脱毒试管苗 鳞茎的诱导和增
11、殖 8.1 脱毒试管苗鳞茎 的诱导 病毒检测后获得的脱毒百合试管苗培养 30 d后，将增殖的芽丛切下，转入鳞茎诱导培养基。培养基 成分为1/2MS 基本培养基，附加 NAA0.5 mg/L 1.0 mg/L，蔗糖浓度为 60 g/L 100 g/L， pH5.65.8。 DB14/ T 1515 2017 4 30 40 d后分化出小鳞茎。 培养条件为培养温度 （ 252） ，光照强度 2 000 Lx 3 000Lx，光照时间 14 h 16 h/d。 8.2 脱毒试管 鳞茎扩繁 将诱导产生的 试管 鳞茎接种于 MS+6-BA 0.2 mg/L 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L 0
12、.5 mg/ L+6% 10% 蔗糖培养基中，诱导小鳞茎增殖 。 培养 30 40 d后 ， 再转接于 MS+ZT 1.0 mg 3.0 mg/L+IBA 0.5 mg 1.0 mg/L+8% 10%蔗糖培养基中，诱导鳞茎增 殖 膨大 ， 获得健壮鳞茎，用于生根培养。培养条件 同 8.1。 9 脱毒试管 鳞茎生根 9.1 试管鳞茎生根 将增殖 培养获得的 脱毒 鳞茎接种于 1/2MS+NAA 0.1 mg 0.5 mg/L+6% 10%蔗糖培养基中，诱导鳞 茎生根。培养条件为温度 （ 222） ，光照强度 2 000 Lx 3 000Lx，光照时间 14 h 16 h/d。 9.2 试管鳞茎出
13、瓶标准 试管内生根鳞茎直径达到 0.5 cm 1 cm。 9.3 病毒检测 脱毒 试管 鳞茎的抽样和病毒检测同 7.5。 10 脱毒试管鳞茎的 移栽 10.1 炼苗 移栽前将达到出瓶标准的试管鳞茎放置于培养室黑暗处 10 15 d， 移栽前1周置于温室闭瓶炼苗 ， 移栽前 23 d温室开瓶炼苗。 10.1 移栽基质 移栽 基质 用 蛭石、沙、土 1： 2： 3比例混合 均匀，或用 腐叶土、蛭石 1： 1比例 混合基质，基质厚度 10 cm 15 cm。 10.2 移栽技术 温室 移栽时，用清水将 试管 鳞茎根部的培养基洗干净后，植入移栽基质中，种植密度为 100 粒 /m2 140 粒 /m2。 移栽后， 移栽基质一定 要浇透水， 并在其上 搭建小拱棚， 覆 盖塑料薄膜和遮阳网， 4周 后去 遮阳网 ， 有新叶长出后 ， 去塑料薄膜 。 移栽成活后， 可作为脱毒籽球进行田间繁育或直接定 植于大田 栽 培 。 5月 8 月移栽可直接在大田进行，移栽步骤同上。 _
