1、ICS 65.020.20 B 05 DB14 山西省 地方标准 DB 14/T 1510 2017 玉米镰孢穗腐病抗性鉴定 牙签接种技术规程 2017 - 12 - 10发布 2018 - 02 - 10实施 山西省质量技术监督局 发布 DB 14/T 1510 2017 I 目 次 前言 . II 1 范围 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3 术语和定义 . 1 4 菌种分离 . 2 5 菌种繁殖 . 2 6 接种 . 3 7 田间管理 . 3 8 病情调查 . 3 9 抗性评价 . 4 附录 A（资料性附录） 玉米镰孢穗腐病病原 . 5 附录 B（资料性附录） 玉米镰孢穗腐病相关病菌
2、的分子检测 . 7 DB 14/T 1510 2017 II 前 言 本标准根据 GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由山西农业大学提出并归口。 本标准起草单位：山西农业大学农学院 。 本 标准主要起草人：张作刚、王建明、李新凤、高俊明、胡春艳、曹挥、王春伟、王燕。 DB 14/T 1510 2017 1 玉米镰孢穗腐病抗性鉴定 DB 14/T 1510 2017 2 牙签接种技术 规程 DB 14/T 1510 2017 3 牙签接种技术规程 DB 14/T 1510 2017 4 牙签接种技术规程 1 范围 本标准规定了玉米镰孢穗腐病抗性鉴定牙签接种的菌种分离、菌种繁殖、接种
3、、田间管理、病情调 查及抗性评价。 本标准适用于栽培玉米（ Zea mays L.）自交系、杂交种、群体、开放授粉品种以及野生玉米和玉米 近缘种对玉米镰孢穗腐病抗性的田间鉴定和评价。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 NY/T 1248.8 玉米抗病虫性鉴定技术规范 第 8 部分 ： 镰孢穗腐病。 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 镰孢穗腐病 由串珠镰孢（ Fusarium verticillioides）、禾谷镰孢（ Fusar
4、ium graminearum）等镰孢菌侵染而 引起的玉米雌穗部分或全部籽粒及穗轴腐烂的病害。 3.2 带菌牙签 上面 长有接种用菌种的牙签。 3.3 牙签接 种 将带菌牙签接种于植物适宜的部位。 3.4 级别 定量植物个体或群体发病程度的数值化描述。 3.5 抗性评价 DB 14/T 1510 2017 5 根据采用的技术标准判别植物寄主对特定病虫害反应程度和抵抗水平的描述。 4 菌种分离 4.1 分离 以常规组织分离法从发病玉米籽粒中分离穗腐病致病镰孢菌。分离物经形态学鉴定确认为镰孢菌 (Fusarium sp.) 后，进行分离物的单孢纯化。 4.2 致病性 测 定 通过玉米穗部接种或幼苗
5、根系接种明确分离物致病性。将发病的组织再分离培养，分离物再通过形 态学方法，必要时结合现代分子生物学技术确定其种类 。 5 菌种繁殖 5.1 菌种准备 无菌条件下将病原镰孢菌接种在直径 9 cm培养皿中的 PDA平板培养基上， 25 恒温培养 78 d，菌 种长满平板后冷藏待用 。 5.2 麦粒准备 将100 g麦粒放300 mL三角瓶中，清水浸泡 12 h24 h，中间冲洗 12次，待麦粒吸足水后，再用清 水冲洗 23次，然后篦去三角瓶中的水，盖上棉塞，待灭菌。 5.3 牙签准备 5.3.1 洗煮牙签 将牙签在清水中浸泡 12 h 24 h，用清水冲洗后在锅中用清水煮10 min 15 mi
6、n，倒掉煮水后再用清 水冲洗 23次。 5.3.2 渗入营养 将清水洗煮过的牙签放在锅中，加清水浸过牙签，然后每 1 000 mL清水再加入 200 g去皮马铃薯小 块和 15 g20 g葡萄糖制成营养液，一起煮 20 min 30 min。 5.3.3 沾拌面粉 将营养液中煮过的牙签捞出，趁牙签表面湿润时随即放入加有 1%琼脂粉的小麦面粉中，搅拌使牙 签表面均匀地沾满面粉。每 8001 000根牙签需用小麦面粉 30 g 50 g。 5.3.4 牙签装袋 将沾满面粉的牙签轻放在菌袋中，使牙签之间保持一定的空隙，装满后扎住菌袋口，做成牙签菌袋。 每袋装 8001 000根牙签。 5.4 高压灭
7、菌 将牙签菌袋与准备的麦粒高压 蒸汽灭菌 20 min。 DB 14/T 1510 2017 6 5.5 麦粒拌菌 无菌条件下，先用接种针或接种环将所准备菌种的菌丝体和培养基一起划碎，再将其接入灭菌的麦 粒中， 摇动三角瓶使菌种与麦粒混均，做成带菌麦粒。 100 g麦粒 接一 培养皿平板菌种。 5.6 菌袋接种 无菌条件下，将带菌麦粒倒入灭菌的菌袋牙签中，扎住袋口，轻轻地上下左右翻动菌袋，使菌种充 分粘着到牙签上以及麦粒均匀分散在牙签之间的缝隙中。每 8001 000根牙签需用带菌麦粒 30 g 50 g。 5.7 培养保存 将接种后的牙签菌袋在 25 温度下培养 710 d，待牙签表面长满了
8、菌丝，即完成带菌牙签的培养。 暂时不用，可将菌袋放4 条件下冷藏保存。 6 接种 6.1 接种时期 玉米吐丝 10 15 d，即乳熟期接种。 6.2 接种方法 先用直径 3 mm金属锥子或钻头在雌穗中下部较粗的部位稍斜向上径向钻孔，孔深达穗轴中部，然 后插入 2根带菌牙签。 7 田间管理 玉米接种后，按玉米正常管理要求进行田间管理。 8 病情调查 8.1 调查时间 玉米生理成熟后。 8.2 调查记载 将接种雌穗剥开苞叶，逐穗估测病部面积占总面积的百分比，按病情分级标准记载各穗的病情级别， 计算出每份鉴定材料的平均病情级别。雌穗病情级别分级标准如表 1。雌穗发病面积的模拟图如图 1, 图 左为经
9、花丝通道接种后的发病模拟，图右为苞叶穿刺接种后的发病模拟 . 表 1 玉米穗腐病病情级别划分 DB 14/T 1510 2017 7 病情分级 描 述 1 发病面积占雌穗总面积 0 1% 3 发病面积占雌穗总面积 2% 10% 5 发病面积占雌穗总面积 11% 25% 7 发病面积占雌穗总面积 26% 50% 9 发病面积占雌穗总面积 51% 100% 图 1 玉米雌穗发病面积模拟图（ 仿 Reid et al.1996） 9 抗性评价 依据每份鉴定材料 的平均病情级别确定其抗病级别，划分标准见表 2。当设置的感病对照材料 （ B73）发病平均级别 5.6时，该批次鉴定视为有效。对重复鉴定结果
10、，以记载的最高病情级别为最终 鉴定结果，并依此结果对鉴定材料进行抗病性评价。 表 2 玉米穗腐病抗性评价标准 平均病情级别 抗 性 1.5 高抗 Highly resistant （ HR） 1.6 3.5 抗 Resistant （ R） 3.6 5.5 中抗 Moderately resistant （ MR） 5.6 7.5 感 Susceptible （ S） 7.6 9.0 高感 Highly susceptible （ HS） DB 14/T 1510 2017 8 A A 附 录 A （资料性附录） 玉米镰孢穗腐病病原 A.1 串珠镰孢 A.1.1 学名 A.1.1.1 无性态
11、串珠镰孢，学名： Fusarium.moniliforme Sheldon，异名：拟轮枝镰孢， F.verticillioides（ Sacc.） Nirenberg， Oospora verticillioides Sacc. A.1.1.2 有性态 串珠赤霉，学名： Gibberella moniliformis Wineland A.1.2 形态特征 A.1.2.1 无性态 在 PSA培养基上气生菌丝绒状至粉状，白色、淡紫色 ，有时产生橙色分生孢子座；基物表面紫色； 小型分生孢子数量多，卵形、椭圆形；大型分生孢子镰孢形，细长，顶胞渐尖，基胞足跟明显或不明显， 隔膜易消解， 3 5隔膜，多
12、数 3隔膜； 3隔孢子大小为（ 20 42） mm（ 3 4.5） mm， 5隔孢子大小为（ 32 54） mm（34.5 ） mm，厚垣孢子未见；产孢细胞单瓶梗，分枝或不分枝。 A.1.2.2 有性态 子囊壳球形或卵形，表面粗糙，大小为（ 250 330） mm（ 200 280） mm；子囊圆筒形，大小为 （ 90 120） mm（ 7 9） mm，内含孢子4 6个，间有 8个；子囊孢子椭圆形， 双细胞，或 3 4个细胞， 大小为（ 14 18） mm（ 4.4 7） mm。 A.2 禾谷镰孢 A.2.1 学名 A.2.1.1 无性态 禾谷镰孢，学名： Fusarium graminear
13、um Clade， 异名：Fusarium roseum Link A.2.1.2 有性态 玉蜀黍赤霉，学名： Gibberella zeae（ Schwein.） Petch，异名：Botryosphaeria saubinetii ， Dichomera saubinetii， Dothidea zeae， Gibbera saubinetii， Gibberella roseum， Gibberella saubinetii， Sphaeria saubinetii， Sphaeria zeae A.2.2 形态特征 DB 14/T 1510 2017 9 A.2.2.1 无性态 在 P
14、DA培养基上气生菌丝绒状，茂密，白色至淡橙黄色，后期产生橙色分生孢子座，在培养基中产 生红色色素。无小型分生孢子；大型分生孢子镰孢形，中等弯曲或略直，顶胞渐尖，基胞足跟明显， 5 6隔膜，大小为（ 40 54） mm（ 3 4.5） mm；厚垣孢子间生，单个或串生，无色至浅褐色，长 10 mm 12 mm；产孢细胞单瓶梗，分枝或不分枝。 A.2.2.2 有性态 子囊壳在禾本科植物基质上产生；子囊壳成堆，球形或卵形，表面粗糙，直径 140 mm250 mm ； 子囊棒状，大小为（ 60 85） mm（ 8 11） mm，内含孢子 8个，间有 4 6个；子囊孢子无色，弯曲镰 刀状，两端钝圆， 3隔
15、，大小为（ 19 24） mm（ 3 4） mm。 DB 14/T 1510 2017 10 B B 附 录 B （资料性附录） 玉米镰孢穗腐病相关病菌的分子检测 B.1 穗腐致病镰孢种的特异性分子检测 玉米穗粒上常见镰孢菌种的特异性分子检测引物及扩增片段信息见表 B.1。 表 B.1 玉米籽粒上常见镰孢菌种的特异性分子检测信息 镰孢菌种 引物名称 引物序列 (5 3) 扩增片段 (bp) 镰孢菌属 Fusarium spp. ItsF AACTCCCAAACCCCTGTGAACATA 431 ItsR TTTAACGGCGTGGCCGC 禾谷镰孢复合种 F. graminearum Clad
16、e Fg16NF ACAGATGACAAGATTCAGGCACA 280 Fg16NR TTCTTTGACATCTGTTCAACCCA 串珠镰孢 F.verticillioides VER1 CTTCCTGCGATGTTTCTCC 578 VER2 AATTGGCCATTGGTATTATATATCTA B.2 禾谷镰 孢复合种 TEF-1 基因片段扩增 禾谷镰孢复合种的TEF -1基因扩增引物信息： TEF-F (5-ATGGGTAAGGARGACAAGAC-3) ， TEF-R (5-GGARGTACCAGTSATCATGTT-3)。正向引物 TEF-F位于 TEF-1基因序列的 1060 1080碱基，反向引物 TEF-R位于TEF-1 基因序列的 1743 1762碱基，扩增片段大小为 703 bp。 _
