1、ICS 67.250 X 08 DB13 河北省 地方标准 DB 13/T 5155 2019 食品金属包装内壁涂层中三聚氰胺和双酚 A 迁移量的测定 2019 - 12 - 27 发布 2020 - 01 - 28 实施 河北省市场监督管理局 发布 DB13/T 5155 2019 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由河北省市场监督管理局提出。 本标准起草单位：河北省食品检验研究院、河北养元智汇饮品股份有限公司、清华大学、中国人 民大学 。 本标准主要起草人： 第一法 主要起草人为范素芳、张岩、李强、俞婧、张雷雷、夏军霞、孟志娟、 李岩 ；第二法主要起
2、草人为龙峰、施汉昌、范素芳、张岩、 夏军霞 。 DB13/T 5155 2019 1 食品金属包装内壁涂层中三聚氰胺和双酚 A 迁移量的测定 1 范围 本标准规定了 食品金属包装内壁涂层中三聚氰胺和双酚 A迁移量的测定方法。 本标准适用于食品金属包装内壁涂层中三聚氰胺和双酚 A迁移量的测定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 5009.156 食品安全国家标准 食品接触材料及制品迁移实验预处理方法通则 GB/T 6682 分析实验室用水规格和实
3、验方法 GB 31604.1 食品安全国家标准 食品接触材料及制品迁移试验通则 第一法 气相色谱 -串联质谱法 3 原理 食品金属包装内壁涂层采用食品模拟物浸泡，三聚氰胺和双酚 A迁移到浸泡液中，取一定量的模拟 物浸泡液经提取、净化、衍生后进气相色谱 -质谱仪测定，溶液中三聚氰胺和双酚 A通过毛细管色谱柱 分离，外标法定量。 4 试剂 和 材料 除 非 另有 说明 ， 本方法所用试剂 均为分析纯 ， 水为 GB/T 6682规定的一级水 。 试验中容器及转移器 具应避免使用塑料材质。 4.1 试剂 4.1.1 甲醇 ： 色谱纯。 4.1.2 乙腈：色谱纯。 4.1.3 吡啶 ： 色谱纯。 4.
4、1.4 衍生化试剂： N,O-三甲基硅基三氟乙酰胺（ BSTFA） +三甲基氯硅烷（ TMCS）（ 99+1， V/V）， 色谱纯。 4.1.5 植物油：符合 GB 5009.156 的要求。 4.2 试剂配制 DB13/T 5155 2019 2 4.2.1 水基、酸性、酒精类、油基食品模拟物的配制：按 GB 5009.156 操作。 4.3 标准品 4.3.1 三聚氰胺标准品（ C3H6N6， CAS 号： 108-78-1），纯度 99.0 % ，或经国家认证并授予标准物 质证书的标准品。 4.3.2 双酚 A 标准品（ C15H16O2， CAS 号： 80-05-7），纯度 99.0
5、 % ，或经国家认证并授予标准物质 证书的标准品。 4.4 标准溶液配制 4.4.1 三聚氰胺标准储备液（ 1 mg/mL）：准确称取 0.0500 g（精确至 0.1 mg）三聚氰胺标 准物质到 50 mL 容量瓶，加入 40 mL 水，在水浴（温度为 70 ）中超声 15 min 30 min，使三聚氰胺能够充 分溶解，冷却至室温后用水定容，将溶液转移至棕色试剂瓶中， 4 20 条件下保存， 6 个月内 浓度保持稳定。 4.4.2 双酚 A 标准储备液（ 1 mg/mL）：准确称取 0.0500 g（精确至 0.1 mg）双酚 A 标准物质到 50 mL 容量瓶，用甲醇溶解、定容至刻度，摇
6、匀，静置，将溶液转移至棕色试剂瓶中， 0 4 条件下保 存， 6 个月内浓度保持稳定。 4.4.3 三聚氰胺和双酚 A 混合标准工作液（ 10 g/mL）：精密 量取 1 mg/mL 的三聚氰胺标准储备液 和双酚 A 标准储备液各 1.0 mL，于 100 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，静置。将溶液转移 至棕色玻璃瓶中， 0 4 保存，有效期 1 个月。 4.5 材料 4.5.1 有机相微孔滤膜： 0.22 m。 5 仪器与设备 5.1 气相色谱 -三重四级杆质谱联用仪：配有电子轰击源（ EI）。 5.2 分析天平：感量 0.1 mg 和 0.01 mg。 5.3 涡旋振荡器。 5.
7、4 氮吹仪 :可控温。 6 分析 步骤 6.1 食品模拟物试液制备 6.1.1 食品模拟物浸泡液的制备 按照 GB 5009.156及 GB 31604.1的要求，选择对应的食品模拟物以及迁 移实验条件进行迁移试验， 可以得到食品模拟物浸泡液。如果食品模拟物浸泡液不能马上进行下一步试验，应将食品模拟物浸泡 液于 0 4 冰箱中避光保存。 在食品模拟物浸泡液温度与室温一致后，进行下一步试液的制备。 DB13/T 5155 2019 3 6.1.2 食品模拟物试液的制备 6.1.2.1 水性、酸性、酒精类食品模拟物试液 准确称取迁移试验后得到的水性、酸性、酒精类食品模拟物浸泡液 2 mL，待用。
8、6.1.2.2 油性食品模拟物试液 分别称取 5 g（精确至 0.01 g）油基食品模拟物至具塞玻璃试管中， 加入 5 mL正己烷，混匀，加入 5 mL甲醇 -水混合溶液（ 1+1， V/V），涡旋振荡 2 min，静置分层。吸取下层水溶液 2 mL，待用。 6.1.3 空白试液的制备 未与食品金属包装内壁涂层接触的水性、酸性、酒精类食品模拟物按照 6.1.2.1操作，油性食品模 拟物按照 6.1.2.2操作，过滤后所得为空白试液。 6.2 提取 取 食品模拟物标准工作溶液 、食品模拟物试液、空白试液 2 mL于 15 mL离心管中，准确加入 4 mL 乙腈， 剧烈振荡提取 10 min， 4
9、000 r/min离心 10 min，吸取清液 4 mL于 15 mL离心管 中，待净化。 6.3 净化 将待净化的清液置于 -20 低温箱中冷冻 30 min至分层，准确吸取上层 清液 2.0 mL，于 70 水浴 中氮气吹干，待衍生化。 6.4 衍生化 取上述氮气吹干残留物，加入 500 L的吡啶和 100 L衍生化试剂（ 4.1.4），混匀 , 置 70 5 烘箱中，衍生反应 30 min, 待测。 6.5 仪器参考条件 6.5.1 色谱条件 色谱参考条件如下： a) 色谱柱： HP-5MS 毛细管色谱柱 (30 m0.25 mm， 0.25 m)，或相当者 ； b) 载气：氦气，流速
10、1.2 mL/min； c) 进样口温度： 250 ； d) 进样量： 1.0 L，不分流进样，溶剂延迟 4 min； e) 程序升温：初始柱温 75 ，保持 1 min，以 30 /min升至 220 ，再以 5 /min升至 280 ， 保持 2 min。 6.5.2 质谱条件 质谱参考条件如下： a) 电离方式：电子轰击电离（ EI)； b) 电离能量： 70 eV； c) 离子源温度： 230 。 d) 扫描方式：多反应监测模式 (multi-reaction monitoring， MRM)，分析物的质谱参数见表 1。 三聚氰胺和双酚 A 总离子流图见附录 A。 DB13/T 515
11、5 2019 4 表 1 分析物的质谱参数 分析物名称 母离子（ m/z) 定量离子 （ m/z) 碰撞能（ V） 子离子（ m/z) 碰撞能（ V） 双酚 A 356.8 73.0 40 191.0 20 三聚氰胺 342.0 327.0 15 171.0 15 6.6 食品模拟物试样溶液的测定 6.6.1 食品模拟物标准工作溶液的制备 6.6.1.1 水性、酸性、酒精类食品模拟物标准工作溶液 分别吸取三聚氰胺和双酚 A混合标准工作溶液（ 4.4.3） 0 mL、 0.01 mL 、 0.025 mL、 0.05 mL、 0.1 mL、 0.2 mL、 0.25 mL于 50 mL容量瓶中，
12、分别用水性食品模拟物定容，其中三聚氰胺和双酚 A的浓度分 别为 0 g/L、 2 g/ L、 5 g/ L、 10 g/ L、 20 g/ L、 40 g/ L、 50 g/L。采用相同方式， 分别用酸性、酒精类食品模拟物配制同样浓度系列的三聚氰胺和双酚 A标准工作溶液。 6.6.1.2 油性食品模拟物标准工作溶液 分别称取 5 g（精确至 0.01 g）油基食品模拟物至 7个具塞玻璃试管中，分别移取 0 L、 1 L 、 3 L、 5 L、 10 L、 20 L、 25 L三聚氰胺和双酚 A混合标准工作溶液（ 4.4.3），得到浓度分别为 0 g/kg、 2 g/kg、 6 g/kg、 10
13、 g/kg、 20 g/kg、 40 g/kg、 50 g/kg的标准工作溶液。分别 在每个试管 中再加入 5 mL正己烷，混匀，加入 5 mL甲醇 -水混合溶液（ 1+1， V/V），涡旋振荡 2 min， 静置分层。吸取下层水溶液 2 mL，待用。 6.6.2 定性测定 按照仪器参考条件 (6.5)测定食品模拟物试样溶液和标准工作溶液 ， 如果食品模拟物试样溶液的质 量色谱峰保留时间与标准溶液在 2.5 %范围内；定性离子对的相对丰度与浓度相当的混合基质标准溶 液的相对丰度一致 ， 相对丰度偏差不超过表 2的规定 ， 则可判断样品中存在相应的待测物。 表 2 定性测定时相对离子丰度的最大允
14、许偏差 相对离子丰度， k/% k50 20k50 10k20 k10 允许的相对偏差 /% 20 25 30 50 6.6.3 标准曲线的制作 以食品模拟标准工作溶液中三聚氰胺和双酚 A浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准工作溶 液，得到线性方程。 6.6.4 定量测定 将试样溶液注入气相色谱 -质谱联用仪中，得到峰面积，根据标准曲线得到待测液中三聚氰胺和双 酚 A的浓度。 6.7 空白试验 空白试验系指除不加试样外 ， 采用完全相同的分析步骤、试剂和用量 ， 进行平行操作。 DB13/T 5155 2019 5 7 分析结果的表述 7.1 食品模拟物试液中三聚氰胺、双酚 A 浓度的计算
15、 由标准曲线得到食品模拟物中三聚氰胺和双酚 A的浓度 ， 分以下两种情况计算： a) 水性、酸性、酒精类食品模拟物试液中三聚氰胺、双酚 A 浓度按式 (1)计算 。 （ 1） 式中： Xi -试样中 三聚氰胺、 双酚 A的含量， 单位为毫克每升（ mg/L） ； -上机样液中 三聚氰胺、 双酚 A的含量， 单位为毫克每升（ mg/L） ； V -定容体积， 单位为毫升（ mL） ； K -稀释倍数； v -样品体积， 单位为毫升（ mL） 。 b) 油性 食品模拟物试液中三聚氰胺、双酚 A 浓度按式 (2)计算 。 （ 2） 式中： Xi -样品中 三聚氰胺 、 双酚 A的含量 ，单位为毫克每
16、千克 （ mg/kg）； -上机样液中三聚氰胺、 双酚 A的含量 ，单位为毫 克每升 （ mg/L）； V-定容体积，单位为毫升 （ mL）； K -稀释倍数； m -样品质量，单 位为克（ g） 。 7.2 三聚氰胺、双酚 A 特定迁移量的转化 计算 得到的 食品模拟物试液中 三聚氰胺和双酚 A浓度，按 GB 5009.156进行迁移量的计算，得到食品模 拟物中三聚氰胺和双酚 A的迁移量。结果保留三位有效数字。 8 精密度 重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的 10 %。 9 检出限和定量限 本方法对水性、酸性、酒精类食品模拟物中三聚氰胺、双酚 A的检出限为 0.
17、05 mg/L，油性食品模 拟物中三聚氰胺、双酚 A的检出限为 0.05 mg/kg。 本方法对水性、酸性、酒精类食品模拟物中三聚氰胺、双酚 A的定量限为 0.1 mg/L，油性食品模拟 物中三聚氰胺、双酚 A的定量限为 0.1 mg/kg。 第二法 倏逝波荧光传感器法 10 原理 DB13/T 5155 2019 6 将待测物（三聚氰胺和双酚 A）和牛血清白蛋白合成的包被抗原（ SM-BSA、 BPA-BSA）共 价结合到 光纤探头表面。激发光在光纤谈都内中以全内反射方式传播并在其表面上形成倏逝波场，该倏逝波可 以激发与包被抗原特异性结合抗体上标记的荧光分子。基于间接竞争免疫分析原理，利用荧
18、光强度与 待测样品中目标物浓度的线性关系实现其定量检测。 11 试剂和材料 除 非 另有 说明 ， 本方法所用 试剂均为分析纯 ， 水为 GB/T 6682规定的一级水 。 试验中容器及转移器 具应避免使用塑料材质。 11.1 试剂 11.1.1 甲醇：色谱纯。 11.2 试剂配制 11.2.1 水基、酸性、酒精类、油基食品模拟物的配制：按 GB 5009.156 操作。 11.3 标准品 11.3.1 三聚氰胺标准品（ C3H6N6， CAS 号： 108-78-1），纯度 99.0 % ，或经国家认证并授予标准物 质证书的标准品。 11.3.2 双酚 A 标准品（ C15H16O2， CA
19、S 号： 80-05-7），纯度 99.0 % ，或经国家认证并授予标准物质 证书的标准品。 11.3.3 三聚氰胺荧光标记抗体 ： Cy5.5 荧光标记抗体，浓度为 0.2 mg/L。 11.3.4 双酚 A 荧光标记抗体： Cy5.5 荧光标记抗体，浓度为 0.5 mg/L。 11.4 标准溶液配制 11.4.1 三聚氰胺标准储备液（ 1 mg/mL）：准确称取 0.0500 g（精确至 0.1 mg）三聚氰胺标准物质 到 50 mL 容量瓶，加入 40 mL 水，在水浴 （温度为 70 ）中超声 15 min 30 min，使三聚氰胺能够 充分溶解，冷却至室温后用水定容，将溶液转移至棕色
20、试剂瓶中， 4 20 条件下保存， 6 个月 内浓度保持稳定。 11.4.2 双酚 A 标准储备液（ 1 mg/mL）：准确称取 0.0500 g（精确至 0.1 mg）双酚 A 标准物质到 50 mL 容量瓶，用甲醇溶解、定容至刻度，摇匀，静置，将溶液转移至棕色试剂瓶中， 0 4 条件下 保存， 6 个月内浓度保持稳定。 11.4.3 三聚氰胺标准工作液（ 10 g/mL）：精密量取 1 mg/mL 的三聚氰胺标准储备液 1.0 mL，于 100 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，静置。将溶液转移至棕色玻璃瓶中， 0 4 保存， 有效期 1 个月。 11.4.4 双酚 A 标准工作液（
21、 10 g/mL）：精密量取 1 mg/mL 的双酚 A 标准储备液 1.0 mL，于 100 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，静置。将溶液转移至棕色玻璃瓶中， 0 4 保存，有效期 1 个月。 11.5 材料 DB13/T 5155 2019 7 11.5.1 有机相微孔滤膜： 0.22 m。 12 仪器与设备 12.1 倏逝波 荧光 传感器（含特异性传感 探头 ）。 12.2 分析天平：感量 0.1 mg 和 0.01 mg。 13 分析 步骤 13.1 食品模拟物试液制备 13.1.1 食品模拟物浸泡液的制备 按照 GB 5009.156及 GB 31604.1的要求，选择对应的
22、食品模拟物以及迁移实验条件进行迁移试验， 可以得到食品模拟物浸泡液。如果食品模拟物浸泡液不能马上进行下一步试验，应将食品模拟物浸泡 液于 0 4 冰箱中避光保存。 在食品模拟物浸泡液温度与室温一致后，进行下一步试液的制备。 13.1.2 食品模拟物试液的制备 13.1.2.1 水性、酸性、酒精类食品模拟物试液 准确称取迁移试验后得到的水性、酸性、酒精类食品模拟物浸泡液 2 mL，待用。 13.1.2.2 油性食品模拟物试液 分别称取 5 g（精确至 0.01 g）油基食品模拟物至具塞玻璃试管中， 加入 5 mL正己烷，混匀，加 入 5 mL甲醇 -水混合溶液（ 1+1， V/V），涡旋振荡 2
23、 min，静置分层。吸取下层水溶液 2 mL，待用。 13.1.3 空白试液的制备 未与食品金属包装内壁涂层接触的水性、酸性、酒精类食品模拟物按照 13.1.2.1操作，油性食品 模拟物按照 13.1.2.2操作，过滤后所得为空白试液。 13.2 食品模拟物试样溶液的测定 13.2.1 食品模拟物标准工作溶液的制备 13.2.1.1 水性、酸性、酒精类食品模拟物标准工作溶液 分别吸取三聚氰胺标准工作溶液（ 11.4.3） 0 mL、 0.05 mL 、 0.1 mL、 0.2 mL、 0.4 mL、 0.5 mL、 1.0 mL于 50 mL容量瓶中，用水性食品模拟物定容，其中三聚氰胺和双酚
24、A的浓度分别为 0 g/L、 10 g/L、 20 g/L、 40 g/L、 80 g/L、 100 g/L、 200 g/L。采用相同方式，分别用酸性、酒精类 食品模拟物配制同样浓度系列的三聚氰胺标准工作溶液。 分别吸取双酚 A标准工作溶液（ 11.4.4） 0 mL、 0.025 mL、 0.05 mL、 0.1 mL、 0.2 mL、 0.25 mL、 0.5 mL于 50 mL容量瓶中，用水性食品模拟物定容，其中双酚 A的浓度分别为 0 g/L、 5 g/L、 10 g/L、 20 g/L、 40 g/L、 50 g/L、 100 g/L。采用相同方式，分别用酸性、酒精类食品模拟物配制
25、同样 浓度系列的双酚 A标准工作溶液。 DB13/T 5155 2019 8 13.2.1.2 油性食品模拟物标准工作溶液 分别称取 5 g（精确至 0.01 g）油基食品模拟物至 7个具塞玻璃试管中，分别移取 0 L、 5 L、 10 L、 20 L、 40 L、 50 L、 100 L三聚氰胺标准工作溶液（ 11.4.3），得到浓度分别为 0 g/kg、 10 g/kg、 20 g/kg、 40 g/kg、 80 g/kg、 100 g/kg、 200 g/kg的标准工作溶液。分别在每 个试管中再加入 5 mL正己烷，混匀，加入 5 mL甲醇 -水混合溶液（ 1+1， V/V），涡旋振荡
26、2 min，静置分 层。吸取下层水溶液 2 mL，待用。 分别称取 5 g（精确至 0.01g）油基食品模拟物至 7个具塞玻璃试管中，分别移取 0 L、 2 L、 5 L、 10 L、 20 L、 25 L、 50 L双酚 A混合标准工作溶液（ 11.4.4），得到浓度分别为 0 g/kg、 4 g/kg、 10 g/kg、 20 g/kg、 40 g/kg、 50 g/kg、 100 g/kg的标准工作溶液。分别在每个试管中再加 入 5 mL正己烷，混匀，加入 5 mL甲醇 -水混合溶液（ 1+1， V/V），涡旋振荡 2 min，静置分层。吸取下层 水溶液 2 mL，待用。 13.3 空白
27、试验 空白试验系指除不加试样外 ， 采用完全相同的分析步骤、试剂和用量 ， 进行平行操作。 14 分析结果的表述 14.1 标准曲线的制作 取 200 L食品模拟物标准工作溶液（ 13.2.1）与 200 L的三聚氰胺 Cy5.5荧光标记抗体（浓度物 0.2 mg/L）混合，另取 200 L食品模拟物标准工作溶液（ 13.2.1）与 200 L的双酚 ACy5.5荧光标记抗 体（浓度物 0.5 mg/L）混合，反应 5 min。测定不同浓度待测物响应值。 以 Cy5.5标记抗体制作竞争性抑制曲线，标准曲线以双酚 A、三聚氰胺 浓度 的对数绘制。 14.2 食品模拟物试液中三聚氰胺、双酚 A 浓
28、度的计算 14.2.1 得到的试样溶液中三聚氰胺和双酚 A 浓度，按 GB 5009.156 进行迁移量的计算，得到食品模 拟物中三聚氰胺和双酚 A 的迁移量。结果保留三位有效数字。 a) 水性、酸性、酒精类食品模拟物试液中三聚氰胺、双酚 A 浓度按式 (3)计算： （ 3） 式中： Xi -试样中 三聚氰胺、 双酚 A的含量， 单位为 克每升（ g/L） ； -上机样液中 三聚氰胺、 双酚 A的含量， 单位为 微克每升（ g/L） ； V -定容体积， 单位为毫升（ mL） ； K -稀释倍数； v -样品体积， 单位为毫升（ mL） 。 b) 油性 食品模拟物试液中三聚氰胺、双酚 A 浓度
29、按式 (4)计算： （ 4） 式中： Xi -样品中 三聚氰胺、 双酚 A的 含量， 单位为 微克每 千克（ g/kg） ； -上机样液中 三聚氰胺、 双酚 A的含量 ， 单位为 微克每升（ g/L） ； DB13/T 5155 2019 9 V -定容体积， 单位为毫升（ mL）； K -稀释倍数 ； m -样品质量， 单位为克（ g） 。 15 精密度 重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的 10 %。 16 检出限和定量限 本方法对水性、酸性、酒精类食品模拟物中三聚氰胺、双酚 A的检出限分别为 5.4 g/L和 0.34 g/L，油性食品模拟物中三聚氰胺、双酚
30、A的 检出 限分别为 5.4 g/kg和 0.34 g/kg。 本方法对水性、酸性、酒精类食品模拟物 中三聚氰胺、双酚 A的定量限分别为 12.6 g/L和 0.67 g/L，油性食品模拟物中三聚氰胺、双酚 A的定量限分别为 12.6 g/kg和 0.67 g/kg。 DB13/T 5155 2019 10 附 录 A （资料性附录） 三聚氰胺和双酚 A的总离子流图 三聚氰胺和双酚 A总离子流图见图 A.1。 R T : 0 . 0 0 - 2 4 . 4 9 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 T
31、i m e ( m i n ) 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 R e la ti ve A b u n d a n ce 1 0 . 3 4 7 . 6 8 1 0 . 4 25 . 6 6 8 . 8 6 1 9 . 4 11 7 . 2 84 . 9 1 1 8 . 5 6 1 9 . 8 61 6 . 8 31 5 . 4 79 . 4 2 1 4 . 9 76 . 0 3 1 3 . 8 21 3 . 3 5 2 0 . 6 57 . 1 2 1 1 . 3 48 . 4 9 2 1 . 5 14 . 5 73 . 0 9 2 2 . 5 8 2 3 . 3 70 . 1 1 2 . 3 81 . 1 5 N L : 3 . 0 5 E 7 T IC M S y a n g - 1 图 A.1 三聚氰胺和双酚 A（浓度 20g/L ）的总离子流图 _
