1、ICS 11.220 B 43 DB13 河北省 地方标准 DB 13/T 2892 2018 禽白色念珠菌病综合诊断技术规程 2018 - 12 - 13 发布 2018 - 12 - 31 实施 河北省 市场监督管理局 发布 DB13/T 28922018 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1 2009给出的规则起草。 本标准由河北工程大学提出。 本标准起草单位：河北工程大学 。 本标准主要起草人： 刘建钗、柳焕章、赵振宇、刘娜 、 张鹤平、 姬国强、 李聚芹、乔铁库、刘彦 威、刘艳莉、张良 、董改琳 、薛素琴、 孙冰玉。 DB13/T 28922018 1 禽白色念珠菌病综合诊断 技
2、术 规程 1 范围 本标准规定了 禽 白 色 念珠菌病综合诊断 技术 的临床诊断、 实验室诊断和 综合判 定 。 本标准适用于鸡、鸭、鹅、鸽子、鹌鹑等禽类白色念珠菌病的诊断及其白色念珠菌病原的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 19489-2008 实验室生物安全通用要求 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 GMA-Grocott： 六胺银染色 PCR： 聚合酶链 式 反应 PDA： 马铃薯葡萄糖琼脂培养基 PAS： 过碘酸雪夫氏染色
3、SYBR Green： DNA荧光 染料 TTC：红四氮唑显色 培养基 TSA：胰蛋白胨大豆琼脂培养基 YEPD：酵母浸出粉胨葡萄糖培养基 4 临床诊断 当禽出现以下部分或全部情形时，可作为初步诊断的依据。 4.1 临床 症状 各日龄禽均可感染，雏禽易感。病禽 嗉囊 肿胀 ，触感松软，内容物或口水气味酸臭 ；在喙、口腔、 舌有溃疡灶或伪膜； 粪便常伴 有 未充分消化的饲料 ；个别病禽有皮肤结痂或脱毛、眼部感染等 症状 。 4.2 剖检 病变 在口腔、咽喉、食道、嗦 囊和腺胃等消化道黏膜上 有 乳白色斑片、溃疡或鳞屑状病变；严重者 嗉 囊阻塞充血、腺胃壁增厚、肌胃内膜糜烂， 肝脏淤血或有出血斑、
4、坏死灶 ，脾、肾肿大明显，表面白 色坏死灶。 5 实验室诊断 包括常规检测和定量 PCR检测技术。参照 GB 19489-2008的 相关条款。 DB13/T 28922018 2 5.1 常规 检 测 5.1.1 样品的采集 取 病禽 嗉囊、肝脏、肾等病料，放入无菌的平皿中，剪开嗉囊， 用拭子擦拭嗉囊内表面 ，放入 1.5 mL灭菌 EP管中备用 ；其他器官 用无菌剪刀各取小块组织两份，用灭菌水充分冲洗后，一份接种于 YEPD 平 板上（ 1 % 酵母膏， 2 % 蛋白胨 ， 2 %葡萄糖， 2 %琼脂粉 ），一份放入 40 g/L甲醛固定液中待用。 5.1.2 病原菌的分离 纯化与 形态观
5、察 将接种病料的平板放入培养箱， 28 恒温培养，每天观察菌落生长情况； 3 d后用接种环挑取平板 上的疑似菌落，划线接种于 YEPD平板培养基继续分离培养， 3 d后 将疑似单菌落进行涂片、染色和镜检， 取酵母状细胞的对应菌落菌体进一步接种于 PDA试管斜面， 28 培养 3 d后保存备用。 对照白色念珠菌典型菌落形态和菌体形态特征进行初步鉴别 ,参见附录 A,。 5.1.3 显色 培养鉴别 用接种环挑取疑似菌株的菌体，分别划线接种或稀释后涂布于 TTC 和 CHROMagar Candida显色培养 基平板的划定区域，如两者均呈现白色念珠菌特征性色泽即可初步诊断为阳性 ,参见附录 A。 5
6、.1.4 组织 切片检查 将 40 g/L甲醛固定液中样本固定 24 h后取出，经修块、脱水、透明、浸蜡包埋、切片、 HE染色、 PAS 和 GMA染色，显微镜观察组织病理和病原生长情况 ,参见附录 A。 以病料中检查到菌丝或孢子为阳性结果，病料中连续两次检查不到菌丝和孢子为阴性。 5.2 定量 PCR 检测 5.2.1 样品采集 选择有典型症状的病禽，无菌采血 或 病变组织（ 肝 、脾），放入 1.5 mL灭菌 EP管中， 将 EP管编号， 记录样本信息， -20 保存备用。 5.2.2 基因组 DNA 提取 取组织 样本 0.2 g放在研钵中，加入适量液氮，待液氮 即将 挥发殆尽时迅速研磨
7、成粉末状，收集 样 本 0.05 g 0.1 g于 1.5 mLEP管中， 加入 500 L裂解液 （ 400 mM Tris-HCl pH 8.0， 60 mM EDTA pH 8.0， 150 mM NaCl， 1 %sodium dodecyl sulfate） ， 室温放置 10 min； 加 150 L乙酸钾 (pH 4.8)， 漩涡震荡， 离心 12000 g， 1 min，取 上清液放入新试管，加入等体积异丙醇； DNA团块用 70 %乙醇 清 洗，干燥后， 溶解在 50 LTE（ 10 mM Tris， 1 mM EDTA） 中保存 。 5.2.3 引物合成 参照 GenBan
8、k已发表的白念珠菌 rDNA基因内转录间区序列，采用 Primer Express6.0软件设计一对 特异引物（预期扩增片段大小 273 bp）： 上游引物 F： 5 - TTT ATC AAC TTG TCA CAC CAG A-3 下游引物 R： 5 - ATC CCG CCT TAC CAC TAC CG-3 5.2.4 定量 PCR 反应体系和反应程序 采用 25 L 的反应体系： SYBR Premix Ex Taq（ 2 ） 12.5 L，上、下游引物各 0.5 L， DNA 模 DB13/T 28922018 3 板 1.0 L，用双蒸水补足至 25 L。反应程序为： 94 预变
9、性 3 min； 94 10 s， 60 30 s， 72 30 s，进行 35 个循环。 5.2.5 标准曲线和熔解曲线 从白色念珠菌 106 100 copies/L一系列模板特异性克隆的 SYBR Green qPCR反应荧光曲线可 见，在 106 101copies/L浓度范围内荧光曲线呈 “S”形。以线性范围内 6个浓度（ 106 101 copies/L） 的特异性克隆为模板在同样条件下进行 SYBR Green qPCR反应，得到标准曲线和熔解曲线。 5.2.6 结果判断 当待测样品实时荧光定量 PCR检测结果有 “S”型扩增曲线， Ct值 36.5，且 Tm值为 85 时，判定
10、待测 样品 中含有白 色 念珠菌 ，而且可通过 Ct值大小判断 感染的程度 可 参见附录 A。未出现 “ S”型 扩增曲线 和 Tm值，则判断样品中不含白 色 念珠菌。 6 综合判定 结合 临床诊断、 实验室检测结果 ，可确诊禽白色念珠菌病。 DB13/T 28922018 4 附 录 A (资料性附录 ) 菌落形态和菌丝及孢子形态特征 A.1 镜检 将每个取样 EP管封盖， 瞬时振荡，用无菌棉签沾取悬液于 YEPD庆大霉素培养基平板涂划接种，于 28 恒温培养 36 h 48 h；将疑似单菌落取菌体经革兰氏染色和棉蓝染色镜检，将革兰氏阳性反应且 为酵母状细胞的 相应菌落取菌体分别接种于沙保弱
11、培养基平板、玉米粉吐温琼脂培养基平板、 TSA血液 培养基平板和无菌载片，于 28 恒温、保湿培养 3 d 4 d，观察平板菌落特征并直接镜检载片培养物 形态特征。 A.2 判断 沙保弱培养基平板上可见灰白色、光滑的细小菌落， 3 d可见菌落增大、隆起，边缘齐整，乳白色 润泽状， 5 d菌落密集部位长出菌丝； TSA血液培养基平板上菌落 生长较快， 4 d可见菌落边缘与基质内 部有大量丝状菌体出现；玉米粉吐温琼脂培养基平板上菌落 生长较慢， 6 d可见菌落边缘与基质内部有 大量丝状菌体出现。革兰氏染色 和棉蓝染色见菌体大小不等，且可见分隔菌丝。直接镜检载片培养物 可见菌丝（芽管）、厚垣孢子。将
12、同时看到菌丝状菌落、菌丝（芽管）、厚垣孢子形态者记录为阳性 结果。 A.3 TTC 和 CHROMagar 显色培养 用接种环挑取疑似菌株的菌体分别划线接种于两种显色培养基平板的划定区域，在同一平板的相 邻区域分别接种已知白 色 念珠菌作对照；也可将疑似菌株用无菌水稀释，取适当稀释菌悬液涂布鉴别 平板。接种后于 37 恒温培养 2 d 3 d，观察显色结果。以出现乳白色至淡粉色（ TTC）或翠绿色 （ CHROMagar）菌苔（菌落）者 为阳性结果，其他颜色为阴性结果。 A.4 组织中白色念珠菌特异性染色 阳性样本可见嗉囊的黏膜复层扁平上皮明显增厚，并发生角质化和上皮细胞脱落现象，大量菌丝 穿过粘膜上皮 ；肝、 脾中见菌丝或 酵母状细胞 。 _
