1、ICS 65.020.30 B 44 DB12 天津市 地 方 标 准 DB12/T 863 2019 水产微生态制剂 解淀粉芽胞杆菌生产技术 规程 Aquatic probiotics-Technical regulation for production of Bacillus amyloliquefaciens 2019 - 01 - 14发布 2019 - 02 - 15实施 天津市市场监督管理委员会 发布 DB12/T 863 2019 I 前 言 本标准依据 GB/T 1.1 2009标准化工作导则 第 1部分：标准的结构和编写的要求起草。 本标准由天津市农业科学院 提出并 归口。
2、 本标准起草单位： 天津市农业生物技术研究中心。 本标准主要起草人：谢凤行、张峰峰、周可、赵琼、赵玉洁、孙海波 、高宝山 。 DB12/T 863 2019 1 水产微生态制剂 解淀粉芽胞杆菌生产技术规程 1 范围 本标准规定了 解淀粉芽胞杆菌生产中所涉及的生产环境和设备、生产技术流程、 质量检测 和储运 。 本标准适用于 水产微生态制剂解淀粉芽胞杆菌的生产 。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 3095 环境空气质量标准 GB 3838 地
3、表水环境质量标准 GB 20287 农用微生物菌剂 GB/T 26428 饲用微生物制剂中枯草芽孢杆菌的检测 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准 。 3.1 解淀粉芽胞杆菌 bacillus amyloliquefaciens 属于芽胞杆菌科，芽胞杆菌属，杆状，有鞭毛，革兰 氏阳性菌，芽胞椭圆形，中生或近中生。 3.2 原菌种 the original strain 由单菌落分离纯化 ， 并在固体斜面上繁殖保存的菌种 。 3.3 一级菌种 first class strain 原菌种在培养皿上活化，挑取单菌落接种至三角瓶中，振荡培养的菌种。 3.4 二级菌种 second class
4、strain 三角瓶中的菌种接种至种子罐中 ，在种子罐中放大培养的菌种。 4 生产环境和设备 要求 4.1 生产环境 4.1.1 厂区空气质量 符合 大气环境质量标准 GB 3095中 类 要求。 4.1.2 发酵用水 符合 地表水 环境 质量标准 GB 3838中 类 水质 要求 ， 冷却水及其他用水 符合 该标准中 类水质要求 。 4.1.3 生产车间配备消毒灭菌设施，菌种储藏室和无菌操作间与生产车间分开。 DB12/T 863 2019 2 4.2 生产设备 生产设备 需 为不锈钢 发酵罐 ，体积根据生产规模自定 。 5 生产技术流程 5.1 生产流程 生产 技 术流程见附录 A 5.2
5、 菌种质量 5.2.1 用于发酵的菌种应有菌种鉴定报告或菌株来源相关信息 。 5.2.2 在发酵前应先检测菌种的纯度和性能，如不纯或退化，应先进行提纯复壮。 5.2.3 菌种在 上罐生产之前 需检测种子罐中菌体的纯度和浓度，不能有杂菌污染，浓度达到每毫升亿 级以上。 5.3 培养基 5.3.1 原菌种和一级菌种的培养基 应 保证菌种生长的延滞期短，生长 旺盛，碳 、 氮源营养丰富。 5.3.2 二级菌种培养基原则上为发酵培养基或接近发酵培养基。 5.3.3 发酵培养基在保证菌体生长旺盛，利于芽 胞 形成的前提下，尽量利用来源充足、价格低廉的原 料。 5.4 灭菌 5.4.1 液体发酵，发酵罐的
6、装液量 50% 70%，液体培养基、发酵设备、管道、补料罐等采用高压蒸汽 灭菌，灭菌条件为 121 125 ， 0.1 MPa 0.15 MPa，灭菌 20 min 30 min。 5.4.2 固体物料含水率 50% 60%， 121 130 ，灭菌 1.0 h 2.0 h。 5.4.3 灭菌后无菌操作取灭菌后的培养基，制片，染色，镜检，无微生物说明灭菌彻底，若有，需重 复 5.3的工作。 5.5 接种 摇瓶种子到发酵罐种子接种量 为 1% 5%，种子罐到发酵罐接种量 为 5% 7%。接种保证无菌操作，调 节进、排气阀， 使接种口有气体排出 。 5.6 发酵 5.6.1 芽 胞 杆菌的发酵温度
7、 为 25 37 。 5.6.2 液体发酵在发酵过程中通入无菌空气，通气量为 10 m3/ht 20 m3/ht，搅拌转数 80 r/min 150 r/min。 5.6.3 芽 胞 率达到 80%以上终止发酵。 5.6.4 发酵 周期 24 h 48 h。 5.6.5 发酵过程加入 天然油脂类或有机硅类 消泡 剂，可采用蠕动泵添加，也可在配置培养基时加入。 5.7 发酵后处理 发酵后的液体菌剂直接分装，或用 沸石粉 、 凹凸棒土等 载体吸附，载体的杂菌率 1.0104 CFU/g， 固体发酵菌剂直接风干。 包装容器应 灭菌 处理 。 DB12/T 863 2019 3 6 质量检测 6.1
8、检测指标 每个批次的产品抽样检测 包括 感官 、水分、 有 效 活菌数 、 芽胞 率 、 杂菌率等指标 ，检验合格方可出 厂。 6.2 感官检测 6.2.1 取 液体菌剂 约 250 mL（固体菌剂 约 250 g） 于无色玻璃杯中，采用目测、鼻嗅的方法进行检验。 6.2.2 液体菌剂为淡黄色或 棕黄色， 存放过程中可能出现 沉淀 ， 具清淡的腥味 ；固体菌剂 棕色或浅棕 色 ，具有 明显的发酵气味。 6.3 有效活菌数、芽 胞 率检测 6.3.1 样品稀释 液体菌剂用灭菌 0.85%的生理盐水梯度稀释 ， 固体菌剂 稀释 方法按照 GB 26428规定执行。 6.3.2 涂平板 有效活菌测定
9、直接用 2 3个梯度稀释液 （ 10-6、 10-7、 10-8） 在含淀粉的培养基 (参见 附录 B)上涂平 板 ，每个梯度涂 3个平板，芽 胞 数则将 2 3个 梯度稀释液 80 处理 10 min后在 含淀粉的培养基 (参见 附 录 B)上涂平板 。 6.3.3 培养 将涂好的平板在室温中放置 15 min， 使接种物完全被琼脂吸收 ， 倒置于培养箱中 37 培养 48 h。 6.3.4 计数 选取菌落数在 30 300个之间的平板计数 ， 典型的解淀粉芽胞杆菌菌落表 面 粗糙 ，不透明，边缘 不 规则 ， 呈浅米黄色 ， 消耗培养基中的淀粉在菌落周围产生透明圈 。 芽 胞 数除以菌数即
10、为 芽 胞 率。 6.4 杂菌率的测定（好氧或兼性厌氧杂菌） 从用来测定有效活菌数且已经过 10倍系列稀释的样品中， 选取 10-5、 10-6、 10-73个稀释度 进行杂菌 率测定。平板 计 数法，按 GB 20287执行 。 6.5 固体菌剂水分含量测定 按 GB 20287执行 。 7 储运 7.1 应贮存在通风、干燥、清洁的仓库，仓库内无有害气体、易燃易爆物品及有腐蚀性的化学物品， 远离热源。 7.2 长途运输时，防止日晒、雨淋 ，避免长期受压和机械损伤。产品不应和易燃、易爆、易腐蚀的物 品同车（或其他运输工具）装运。 A DB12/T 863 2019 4 附 录 A （规范性附录
11、） 解淀粉芽胞杆菌生产技术流程图 图 A.1 解淀粉芽胞杆菌生产技术流程图 原 菌种 一级菌种 二级菌种 配置培养基 接种 发酵 合格 灭菌 质量检测 合格 不合格 按规定处理 出厂 发酵物检测 不合格 按规定处理 发酵后处理 纯度和性能检查 无菌空气 DB12/T 863 2019 5 B B 附 录 B （资料性附录） 计数用培养基 含淀粉培养基成分（ 每升 培养基含量） : 可溶性淀粉： 10 g； 蛋白胨 ： 10 g； 硫酸镁 ： 0.5 g； 磷酸氢二钾 ： 1 g； 碳酸钙 ： 1 g； 琼脂 ： 18 g； 蒸馏水 ： 1000 mL； pH:7.0-7.5； 灭菌条件 ： 121 灭菌 20 min。 _
