1、ICS 65.150 B 50 DB12 天津市 地 方 标 准 DB12/T 865 2019 水和沉积物中硝基呋喃类代谢物残留量的 测定 液相色谱串联质谱法 Determination of nitrofuran metabolic residues in waters and sediment by LC-MS/MS method 2019 - 01 - 14发布 2019 - 02 - 15实施 天津市 市场 监督 管理委员会 发布 DB12/T 865 2019 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由天津市 农业农村委员会 提出并归口。 本标准
2、起草单位：农业农村部渔业环境及水产品质量监督检验测试中心（天津）。 本标准主要起草人：李春青、陈永平、高丽娜、时文博、李宝华。 DB12/T 865 2019 1 水和沉积物中硝基呋喃类代谢物残留量的测定 液相色谱串联质谱 法 1 范围 本标准规定了水及沉积物中硝基呋喃类代谢物残留量测定的试剂、仪器设备、测定步骤、计算、方 法灵敏度、方法回收率、方法精密度。 本标准适用于水和沉积物中 3-氨基 -2-唑烷基酮（呋喃唑酮代谢物，以下简称： AOZ）、 5-甲基吗 啉 -3-氨基 -2-唑烷基酮 （呋喃它酮的代谢物，以下简称： AMOZ）、氨基脲（呋喃西林代谢物，以下简 称： SEM）和 1-氨基
3、 -2-内酰脲（呋喃妥因代谢物，以下简称： AHD）残留量的测定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅 注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 原理 水或沉积物中残留的硝基呋喃类代谢 物在酸性条件下水解，用 2-硝基苯甲 醛衍生化，经乙酸乙酯液 -液萃取净化后，液相色谱 -串联质谱仪测定，内标法定量。 4 试剂 4.1 甲醇：色谱纯。 4.2 醋酸铵：色谱纯。 4.3 二甲基亚砜：色谱纯。 4.4 2-硝基苯甲醛：色谱纯。 4.5 三水
4、合磷酸氢二钾：优级纯。 4.6 乙酸乙酯：色谱纯。 4.7 乙腈：色谱纯。 4.8 盐酸：优级纯。 4.9 0.002 mol/L 醋酸铵溶液：称取 0.15 g 醋酸铵，用水（实验用水当符合 GB/T 6682规定）溶解并 定容至 1000 mL。 4.10 甲醇溶液： 甲醇：水 =5： 95(v/v）。 4.11 0.2 mol/L 盐酸溶液：量取浓盐酸（ =1.19 g/mL） 16.67 mL，用水稀释至 1000 mL。 4.12 0.05 mol/L 2-硝基苯甲醛溶液：称取 0.037 8 g 2-硝基苯甲醛，溶于 5 mL二甲基亚砜中，现 用现配。 4.13 1.0 mol/L
5、磷酸氢二钾溶液：称取 114 g三水合磷酸氢二钾，溶解于 500 mL 水中。 DB12/T 865 2019 2 4.14 标准物质 AOZ、 AMOZ、 SEM HCl 和 AHD HCl：纯度 98% 。 4.15 同位素内标溶液： AOZ-D4、 AMOZ-D5、 SEMHCl-13C-15N2和 AHD13C3，浓度均为 100 g mL。 4.16 AOZ（呋喃唑酮代谢物 ）标准储备溶液： 1.0 mg/mL：准确称取 10.0 mg 0.1 mg AOZ，用甲醇溶 解并定容至 10 mL 棕色容量瓶中， -20冷藏保存，有效期 6 个月。 4.17 AMOZ（呋喃它酮代谢物） 标
6、准储备溶液： 1.0 mg/mL：准确称取 10.0 mg 0.1 mg AMOZ ，用甲 醇溶解并定容至 10 mL 棕色容量瓶中， -20冷藏保存，有效期 6 个月。 4.18 SEM （呋喃西林代谢物） 标准储备溶液 ： 1.0 mg/mL：准确称取 14.9 mg 0.1mg SEM HCl ， 用甲醇溶解并定容至 10 mL 棕色容量瓶中， -20冷藏保存，有效期 6 个月。 4.19 AHD（呋喃妥因代谢物）标准储备溶液： 1.0 mg/mL：准确称取 13.2 mg 0.1 mg AHD HCl，用 甲醇溶解并定容至 10 mL 棕色容量瓶中， -20冷藏保存，有效期 6个月。
7、4.20 硝基呋喃类代谢物混合标准工作溶液：准确吸取 AOZ、 AMOZ、 SEM和 AHD 标准储备溶液，用水逐 级稀释配成 100 ng/mL和 10 ng/mL混合溶液， 4冷藏保存，有效期 1个月。 4.21 硝基呋喃类代谢物混合内标工作溶液：准确吸取同位素内标溶液（ 4.15），用水逐级稀释配成 100 ng/mL 混合溶液， 4冷藏保存，有效期 1个月。 5 仪器和设备 5.1 液相色谱串联四极杆质谱仪：配备电喷雾（ ESI）离子源。 5.2 电子天平：感量 0.000 1 g 和 0.01 mg。 5.3 涡旋混合器。 5.4 恒温水浴振荡器：可控温 37 1 。 5.5 离心机
8、： 4 000 r/min。 5.6 氮气吹干仪。 5.7 冰箱：具备 4 冷藏功能。 6 测定步骤 6.1 样品处理 6.1.1 水样 取充分混匀的水样 100 mL 用 0.45 m滤膜过滤，于 4 冰箱保存。 6.1.2 沉积物 取沉积物样品 100 g，风干至内外部均干燥无水后，研磨成粉状，用 80目圆筛筛分去除大型颗粒， 于 4 冰箱保存。 6.2 水解和衍生化 6.2.1 水样品 量取 10 mL（精确到 0.1 mL， V2）水样于 50 mL离心管中，加入 0.05 mL混合内标工作溶液（ 4.21） 涡旋混合 50 s，再加入 5 mL盐酸溶液（ 4.11）和 0.20 mL
9、 2-硝基苯甲醛溶液（ 4.12），涡旋振荡 50 s 后，置于恒温水浴振荡器中 37 避光振荡 16 h。 6.2.2 沉积物样品 DB12/T 865 2019 3 称取样品 5.00 g（精确到 0.01 g， m），加入 0.05 mL混合内标工作溶液（ 4.21）涡旋混合 50 s， 再加入 5 mL盐酸溶液（ 4.11）和 0.20 mL 2-硝基苯甲醛溶液（ 4.12），涡旋振荡 50 s后，置于恒温 水浴振荡器中 37 避光振荡 16 h。 6.3 提取净化 取出离心管冷却至室温，加入 3 mL 5 mL 磷酸氢二钾溶液（ 4.13），调节 pH 至 7.0 7.5， 加入 8
10、 mL 乙酸乙酯，涡旋振荡 50 s， 4000 r/min 离心 5 min，取上层清液至 20 mL 玻璃离心管中， 再加入 8 mL 乙酸乙酯重复上述操作，合并上清液于 40 下氮气吹干。准确加入 1.0 mL（ V1）甲醇 溶液（ 4.10）涡旋振荡溶解残留物，用 0.22 m 滤膜过滤，待测。（若样品杂质较多，可考虑定容后 用正己烷净化，即加入 2 mL 正己烷涡旋离心后弃去上层，取下清液过 0.22 m 微孔滤膜，待测）。 6.4 标准工作曲线制作 分别准确移取 10 ng/mL混合标准工作液（ 4.20） 0.050 mL、 0.10 mL和 100 ng/mL混合标准工作液 （
11、 4.20） 0.020 mL、 0.040 mL、 0.060 mL、 0.080 mL、 0.10 mL于 7 个 50 mL离心管中，除不加样品外， 按 6.1.2 和 6.1.3 步骤操作，按 6.3 测定，色谱图参见附录 A。 6.5 测定 6.5.1 色谱条件 色谱柱： C18 柱， 100 mm 2.1 mm (i.d.)， 5 m，或其他性能相当的色谱柱； 柱温： 40； 进样量： 20 L； 流动相： A . 0.002 mol/L 醋酸铵溶液； B. 乙腈；梯度洗脱程序见表 1，平衡时间为 5 min。 表 1 流动相梯度洗脱程序 时间（ min） A（ %） B（ %）
12、流速（ ml/min） 0.0 85 15 0.25 1.0 85 15 0.25 4.0 30 70 0.25 8.0 30 70 0.25 8.1 85 15 0.25 10 85 15 0.25 6.5.2 质谱条件 质谱参数应符合以下条件： a) 离子化模式：大气压电喷雾离子源（ ESI） ,正离子模式； b) 喷雾电压： 4 000 v； c) 雾化气压力： 35 psi； d) 辅助气流量： 3 L /min e) 离子传输毛细管温度： 350 ； f) 源内碰撞诱导解离电压： 10 v； g) 扫描模式：选择反应监测（ SRM），选择反应监测母离子、子离子和碰撞能量见表 2； h
13、) Q1 半峰宽： 0.7 Da； i) Q3 半峰宽： 0.7 Da； j) 碰撞气压力：氩气， 1.5 mTorr DB12/T 865 2019 4 表 2 选择反应监测母离子、子离子和碰撞能量 目 标 化合物 母 离子 (m/z) 子离子 (m/z) 碰撞能量 (v) AOZ （呋喃唑酮代谢物） 236 104 19 236 134* 15 AOZ-D4 （呋喃唑酮代谢物内标） 240 134* 12 AHD （呋喃妥因代谢物） 249 104 20 249 134* 12 AHD-13C3 （呋喃妥因代谢物内标） 252 134* 15 SEM （呋喃西林代谢物） 209 166 *
14、 12 209 192 10 SEM-13C-15N2 （ 呋喃西林代谢物内标） 212 168* 11 AMOZ （呋喃它酮代谢物） 335 262 22 335 291* 14 AMOZ-D5 （呋喃它酮代谢物内标） 340 296* 12 注： *表示为定量离子 6.5.3 定性依据 在同样测试条件下，阳性样品保留时间与标准物质保留时间相对标准偏差在 5 % 以内，且检测 到的离子的相对丰度，用与最强离子（基峰）的强度百分比表示，应当与浓度相当的校正标准相对丰度 一致，校正标准可以是校正标准品溶液，也可以是添加了标准物质的样品。次强碎片离子丰度与基峰丰 度比应符合表 3 要求： 表 3
15、基峰与次强碎片离子丰度比要求 次强碎片离子相对丰度（ %） 允许相对偏差 (%) 50 20 20 50 25 10 20 30 10 50 6.5.4 定量测定 定量离子采用丰度最大的二级特征离子碎片（表 2）。 6.6 空白实验 除不加试祥外，按上述 6.2、 6.3 测定步骤和 6.5 测定条件进行测定，色谱图参见附录 B。 7 结果计算 7.1 用仪器自带工作站按内标法进行自动计算，以化合物上机响应的峰面积与内标物峰面积比值为纵 坐标、化合物浓度与内标物浓度比值为横坐 标，绘制标准曲线，再根据样品的峰面积响应值与内标物峰 面积比值，利用标准曲线，得到样品制备液的实际测定浓度。 7.2
16、水样品中硝基呋喃类代谢物残留量按式（ 1）计算。计算结果须扣除空白值。 X=Ci V1/ V2 . (1) 式中： X 样品中硝基呋喃类代谢物的含量，单位为微克每升（ g/L）； DB12/T 865 2019 5 Ci 样品制备液中硝基呋喃类代谢物的浓度，单位为纳克每毫升（ ng/mL）； V1 定容体积，单位为毫升（ mL）； V2 样品体积，单位为毫升（ mL）。 7.3 沉积物样品中硝基 呋喃类代谢物残留量按式（ 2）计算。计算结果须扣除空白值。 X=Ci V1/ m . (2) 式中： X 样品中硝基呋喃类代谢物的含量，单位为微克每千克（ g/kg）； Ci 样品制备液中硝基呋喃类代
17、谢物的浓度，单位为纳克每毫升（ ng/mL）； V1 定容体积，单位为毫升（ mL）； m 样品质量，单位为克（ g）。 8 方法灵敏度 8.1 水中四种硝基呋喃类代谢物的检出限为 0.1 g/L，定量限为 0.2 g/L。 8.2 沉积物中四种硝基呋喃类代谢物的检出限为 1.0 g/kg，定量限为 2.0 g/kg。 9 方法回收率 9.1 水中添加浓度为 0.1 g/L 10 g/L 时回收率为 75 % 110 %。 9.2 沉积物中添加浓度为 1.0 g/kg 10 g/kg 时回收率为 75 % 110 %。 10 方法精密度 本方法的批内相对标准偏差小于 10%，批间相对标准偏差小
18、于 15%。 11 注意事项 硝基呋喃类代谢物衍生物对光敏感，以上操作应在避光条件下进行。 DB12/T 865 2019 6 A A 附 录 A （资料性附录） 四种硝基呋喃类代谢物混合标准（ 2.0 ng/mL）特征离子质量色谱图 DB12/T 865 2019 7 B B 附 录 B （ 资料性附录） 空白沉积物样品特征离子质量色谱图 DB12/T 865 2019 8 C C 附 录 C （资料性附录） 沉积物添加样品特征离子质量色谱图 DB12/T 865 2019 9 D D 附 录 D （资料性附录） 空白水样品特征离子质量色谱图 DB12/T 865 2019 10 E E 附 录 E （资料性附录） 水添加样品特征离子质量色谱图 _
