1、 书书书 前 言 本标准按照 给出的规则起草。 本标准由全国生化检测标准化技术委员会（ ）提出并归口。 本标准起草单位：国家农业标准化监测与研究中心（黑龙江）、深圳市计量质量检测研究院、上海市 计量测试技术研究院、成都大学四川抗菌素工业研究所、吉林省检验检疫局技术中心、哈尔滨商业大学 食品学院、哈尔滨春源生物科技开发有限公司。 本标准主要起草人：王志强、王韦达、董珊、周婕、杜业刚、李兰英、杨晨、容会、张根生、张福源、吴楠、 彭丽萍、王世琨、姜雯、刘文超、孔鲁裔、牟钰、徐凤霞、王海宽、李碧芳、杨俊、李意、刘奕雄、杨国武。 犌犅 犜 生物样品中金属硫蛋白含量的测定 范围 本标准规定了生物样品中兔源
2、金属硫蛋白 型和 型（ 和 ）测定的液相色谱 串联质 谱法。 本标准适用于生物制剂或生物提取物等生物样品中兔源金属硫蛋白 型和 型总含量的测定。 本方法的检出限为 。 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 分析实验室用水规格和试验方法 术语和定义、缩略语 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 特征肽段 狊狆犲犮犻犳犻犮狆狅犾狔狆犲狆狋犻犱犲 唯一在靶蛋白的胰蛋白酶水解产物中发现、其氨基酸序列具有专属性的多肽。 金属硫蛋白 犿犲狋犪犾犾狅狋犺犻狅狀犲犻狀
3、一类富含半胱氨酸且具有高度结合金属能力的低相对分子质量蛋白质。 金属硫蛋白 型和 型 犿犲狋犪犾犾狅狋犺犻狅狀犲犻狀犪狀犱 在大多数哺乳动物的内脏器官中广泛存在，尤以肝、肾细胞为主，而且参加其功能调节的一类蛋 白质。 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 ：二硫苏糖醇（ ） ：碘代乙酰胺（ ） ：金属硫蛋白（ ） 原理 试样经胰蛋白酶酶切后产生特征肽段，用液相色谱 串联质谱法测定试样中特征肽段的含量，按照 兔源 和 平均相对分子质量与特征肽段的相对分子质量比值为 ，计算出试样中 犌犅 犜 和 的总含量。 试剂 试验用水为 中规定的一级水。 碳酸氢铵（ ）：分析纯。 二硫苏糖醇（ ）：生化级。 碘代
4、乙酰胺（ ）：生化级。 胰蛋白酶：测序级，活力大于 （ 是测定胰蛋白酶活性的底物）， 冷冻保存。 甲酸（ ）：色谱纯。 乙腈（ ）：色谱纯。 碳酸氢铵溶液（ ）：称取 碳酸氢铵，用水溶解后定容至 。 二硫苏糖醇溶液（ ）：称取 二硫苏糖醇，用碳酸氢铵溶液溶解后定容至 。 碘代乙酰胺溶液（ ）：称取 碘代乙酰胺，用碳酸氢铵溶液溶解后定容至 。 胰蛋白酶溶液（ ）：移取 胰蛋白酶用 碳酸氢铵溶液溶解。 甲酸溶液（ ，体积分数）：移取 甲酸，用水定容至 。 仪器设备及器具 液相色谱 串联质谱仪：配电喷雾离子源。 蛋白超滤管： （ ）。 蛋白低吸附离心管： 。 天平：感量 、 。 涡旋混合器。 微量移
5、液器： 、 、 。 高速冷冻离心机：最高转速不低于 。 恒温水浴锅： 。 分析步骤 特征肽段合成 序列 为合成肽段，经脱盐纯化工艺，其中的半胱氨酸是由碘代乙酰胺试剂进行了烷基 化修饰，标记为 。合成的特征肽段物质信息见附录 。特征肽段 冷冻保存。 特征肽段溶液配制 特征肽段储备溶液：准确称取肽段 溶于 碳酸氢铵溶液中，制备成 储备 液， 冷冻保存，有效期 个月。 标准工作溶液：用碳酸氢铵溶液稀释上述特征肽段储备溶液，配制成 中含特征肽段质量为 、 、 、 、 、 、 、 和 的工作溶液，现用现配。 犌犅 犜 测定 试样制备 称取 （精确至 ）试样，置于 低吸附离心管中，用 碳酸氢铵溶液溶解，
6、混匀。移取 溶液转移至另一低吸附离心管中，加入 碳酸氢铵溶液，涡旋混匀，待酶解。 试样酶解 取上述试样 置于 低吸附离心管中，依次加 碳酸氢铵溶液， 溶液，混 匀后 恒温水浴 ；冷却至室温，加入 溶液，避光静置 ，对半胱氨酸进行烷基化 修饰；转移全部溶液至预先用碳酸氢铵溶液润湿的蛋白超滤管中， 离心 ；加入 碳酸氢铵溶液洗膜， 离心 ，再重复两次；加入 碳酸氢铵溶液于超 滤管中，再加入 胰蛋白酶溶液，混匀后 恒温水浴酶解 ；将酶反应物 离心洗脱，再加入 碳酸氢铵溶液洗脱，收集两次含特征肽段的洗脱液混匀待测。 仪器参考条件 液相色谱参考条件 液相色谱参考条件如下所示： ） 色谱柱： 柱（ ， ）
7、或柱效相当者； ） 流动相：梯度洗脱条件见表 ； ） 流动相流速： ； ） 色谱柱柱温： ； ） 样品室温度： ； ） 进样体积： 。 表 流动相梯度洗脱参考条件 时间 甲酸溶液（体积分数） 乙腈（体积分数） 质谱参考条件 质谱参考条件如下： ） 离子化模式：电喷雾电离正离子扫描模式； ） 质谱扫描方式：多反应监测（ ）； ） 喷雾电压（ ）： ； ） 雾化气压力（ ）： ； ） 辅助气压力（ ）： ； 犌犅 犜 ） 气帘气压力（ ）： ； ） 离子源温度： ； ） 裂解电压（ ）： ； ） 碰撞能量（ ）： ； ） 的质谱参数：参见表 。 表 犕犚犕 的质谱参数 名称母离子 犿 狕 子离子
8、犿 狕 金属硫蛋白 特征肽段 注：“ ”为定量离子。 定性判定 选择待测组分的 个母离子， 个子离子进行 监控。在相同试验条件下，待测样液中待测物 质的保留时间，与标准工作溶液的保留时间偏差在 之内，且待测样液中待测物定性离子的相对 丰度与浓度接近的标准工作液中对应的定性离子的相对丰度进行比较，最大允许偏差符合表 的规定， 则可判定为试样中存在目标肽段。特征肽段的选择离子色谱图参见附录 。 表 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度 允许的最大偏差 标准曲线的制作 将标准工作溶液依次注入液相色谱 串联质谱仪，测定相应的峰面积。以标准工作溶液的浓度为横 坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准
9、曲线。 试样的测定 将待测样液注入液相色谱 串联质谱仪，按照 确立的参考条件与参数，以 为定量 离子对测得的峰面积进行定量。 空白试验 用 碳酸氢铵溶液，按照 的步骤进行空白试验。 加标试验 试样经过还原、烷基化修饰、洗涤除去 和 后，酶切前或者酶切后添加一定水平含量的特 征肽段，进行加标回收试验，回收率参考范围为 。 犌犅 犜 结果计算 用式（ ）计算试样中 和 的总含量： 犡 犞犱 犿 （ ） 式中： 犡 试样中 和 的总含量， ； 试样溶液中 和 特征肽段的质量浓度，单位为微克每升（ ）； 犞 酶解溶液和洗脱溶液的总体积（ ）； 犱 试样溶液的总稀释倍数（ ）； 犿 试样的质量，单位为克
10、（ ）。 以重复性条件下获得的两次独立测定结果的平均值表示，结果保留两位有效数字。 精密度 在重复性条件下，获得的两次独立测定结果的绝对差值，不得超过算术平均值的 。 犌犅 犜 附 录 犃 （规范性附录） 合成的特征肽段物质信息 犃 合成的特征肽段物质技术要求 合成的特征肽段物质技术要求应符合表 的规定。 表 犃 合成的特征肽段物质信息表 序号名称英文名称要求 序列 相对分子质量 纯度 外观 白色粉末 犃 合成的特征肽段含量测定 犃 测定条件及典型色谱图 犃 测定条件 仪器：高效液相色谱仪，配备紫外检测器； 色谱柱：反相 色谱柱， ， ； 流动相 ： 三氟乙酸乙腈溶液； 流动相 ： 三氟乙酸水
11、溶液； 进样体积： ； 检测波长： ； 流速： ； 梯度洗脱见表 。 表 犃 梯度洗脱 时间 流动相 流动相 停止 犃 合成的特征肽段典型色谱图 合成的特征肽段用高效液相色谱测定，典型色谱图见图 。 犌犅 犜 图 犃 合成的特征肽段典型色谱图 犃 测定结果 用高效液相色谱测定含量，采用面积归一化法进行定量。测定结果列于表 。 表 犃 测定结果 出峰顺序出峰时间 峰面积浓度 犃 合成的特征肽段相对分子质量确证 犃 质谱条件 仪器设备：液相色谱 串联质谱仪； 离子源： ； 扫描模式：正离子扫描； 雾化气流速： ； 离子源电压： ； 犌犅 犜 加热模块温度： ； 温度： ； 液相流速： ； 流动相：水 乙腈 。 犃 合成的特征肽段分子离子质谱图 合成的特征肽段分子离子质谱图见图 。 图 犃 合成的特征肽段的分子离子质谱图 根据质谱图可知，采用 离子模式得到 犿 狕 为 的合成特征肽段离子图，确证合成 的特征肽段的相对分子质量为 。 犌犅 犜 附 录 犅 （资料性附录） 犕犜 和 犕犜 特征肽段的选择离子色谱图 和 特征肽段的选择离子色谱图见图 。 图 犅犕犜 和 犕犜 特征肽段的选择离子色谱图 犌犅 犜
