1、ICS 65. 150 B 51 中华人民共和国国家标准GB 20554-2006 非hm海Kelp 2006-12回01实施2006-09-29发布发布中华人民共和国国家质量监督检验检夜总局中国国家标准化管理委员会, 中华人民共和国国家标准海带GB 20554-2006 当昏中国标准出版社出版发行北京复兴门外三里河北街16号邮政编码，100045网址电话，685239468517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销争号开本880X12301/16 印张0.5字数8千字2006年12月第一版2006年12月第一次印刷号舍书号，155066 1-28577 定价8.00元如有印
2、装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533GB 20554-2006 . 国目。昌本标准的第3章为强制性条款，其余为推荐性条款。本标准的附录A为规范性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出自本标准由全国水产标准化技术委员会海水养殖分技术委员会归口。本标准起草单位:中国水产科学研究院黄海水产研究所、中国科学院悔洋研究所、中国海洋大学。本标准主要起草人t王飞久、段德麟、刘涛、陈四清、张岩、高津仁、于东祥、崔竟进。I GB 20554-2006 海带1 范围本标准给出了海带(LamiriajaonicaAresch)的名称与分类、主要形态构造特征、生活周期与繁殖、遗
3、传学特征以及检测方法。本标准适用于海带的种质监测和鉴定。2 名称与分类2. 1 学名海带(Laminariaj aonzcAresch)。2.2 分类位置褐藻门(Phaeophyta)、游子包子纲(Phaeosporeae)、海带目(Laminariales)、海带科(Laminariaceae)、海带属(LmzariaLamx. )。3 主要形态构造特征3. 1 抱子体外部形态特征器体明显分为国着器、柄和叶片三部分。海带抱子体外部形态见图10l一一固着器F2一一柄;3一一叶片;4一一纵沟;5一一中带部z6一-t缘部。4 5 6 图1海带袍子体的外部形态3. 1. 1 固着器由多次双分枝的圆柱
4、形假根组成，其末端有吸盘。3. 1.2柄呈圆柱形或扁圆柱形，深褐色，成藻柄长3cm6 cmo 3. 1. 3 叶片带状，褐色具光泽，基部幼时棋形，厚成阶段为扁圆形。养殖的海带戚藻一般长2m-4 m，宽20 cm40 cm。野生的海带成藻一般长O.8 m1. 8 m，宽8cm20 cmo有两条浅的纵沟贯穿叶片的中部形成较厚的中带部，叶片边缘薄而软，有波裙。1 G 20554-2006 3.2 抱子体内部构造特征柄和叶片均分三层组织，外层为表皮，其内为皮层，中央为髓部。3. 2. 1 表皮由一层个体小、排列紧密和整齐的细胞组成，呈栅栏状。细胞含i位状色素体。3.2.2 皮层外皮层细胞呈桂状，大小不
5、等，排列不整齐。内;皮层细胞大小相近，排列较整卉。3.2.3 髓部由喇叭丝和髓丝组成。4 生活周期与繁殖4. 1 生活史明显的抱子体与时4.2 生命周期海底自然繁生的、4.3 掣黯4. 3. 1 性成熟年龄5 遗传学特征5. 1 染色体数抱子体细胞染色体数2n- 5.2 DNA序列特征不等世代交替型巳子单细胞，棵形咱长6.9m 8m-19.i!6塌，后面一条长GTCTGTGAGG CCGCTTCGTG 61 CGGCCTCTTT ACCCCGAGAA AGAATTCGTT ATGCGAAGTT GGGCGAGGGG CGCCTCGCCG 121 AGAGCCTGTG AAAAGGCCCT CG
6、AATCAAAG CGCACCCCAC ATTTCAACCC ATT AAACTCT 181 GAATCTGAAC TCAAAGGGGC GCTGCGCTAG CCGCGGCTCC CCCAACCTTT AACGTTGT 5.2.2 ITS-2序列:总长度258bp。1 GACACCACTC GCCCCTCTTC TCTCCTGTCT CACGACGGGG GAGTCGCGGC GGCGGACTTT 61 GAGTGTTCCG GAGTTCCCAT GCTCCGAGTG CACCTAATCT CGTGAACGAA GCCTCTCGCG 121 CCCTGCCGCA CAGAGTTGTT GAC
7、GGCGCTC GCTTCGGCGG CGACTCTCGA CTCACCAAAC 181 GTGCGCAGGA TGCCTGCCTC ATTCCGGCGC TCCGACGCCG ACCCTTCTGG GTCAGCGTCG 241 GAAACCGT AC CACTTTCG 2 6 检测方法6. 1 形态构造检瞌采用肉眼和显微镜观察相结合的方法。6.2 染色体检验6. 2. 1 标本的制备压片法。6.2.2 染色玻2%(质量分数)地衣红榕于70%体积分数)的乙酸中。6.2.3 染色方法GB 20554-2006 固定材料在自来水中浸泡15min30 min后压片。揭开盖片，滴人醋酸地衣红后盖片0.
8、5h.用滤纸吸出多余的染色液，石蜡封片。6.3 海带ITS序列的检测6. 3. 1 海带配子体DNA的提取取约1g(温重的海带配子体，加少量石英t和PVP-40.在液氮中研成粉末。将粉末转至50mL 的离心管中，加人15mL裂解缓冲液(10mmol!L Tris-HC1, 10 mmol/L EDTA, 1. 0 mol/L NaCl, 1. 0% CTAB, l% SDS , pH8. 0)，在650C保温1h，期间摇匀几次。用同体积的三氯甲烧+异戊醇(24+1)抽提一次，再将水相转移至一新的50mL离心管中，加入1/3体积的4mol/L Tris-HC1, 1 mmol/L EDT A ,
9、 pH8. 0中，加2LRNase A，370C保温1h，再用三氯甲烧+异戊醇(24十1)抽提一次，异丙醇沉淀回收DNAoDNA最后溶于一定体积的TE中，检测DNA的浓度。6.3.2 ITS特异性扩增总反应体积为20L，含10mmol/L Tris-HC1(pH 8.3) , 50 mmol/L KCl,1. 5 mmol/L MgC12, Taq polymerase 1 U ，4种dNTP各2mmol/L，两个引物各4mmol/L6 mmol/L.模板DNA10 ng , 其余用双蒸锢水补满。PCR反应参数:960C预变性5min;960C、30s，720C、60s , 55C、30s，3
10、7个循环;720C.保温5mino 6.3.3 ITS序列扩增引物正向引物:5 -AGAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGG-3 ，。反向引物:5 -AATCCTGGTTAGTTTCTTTTCCTC-3 ，。6.3.4 测序参照DNA测序仪进行测序，见附录Ao6.4 判定规则以第3章为主，结合第4章、第6章判断检验样品结果。经检验，符合上述质量要求的样品为合格样品。goNi寸白白ON筒。附录A(规范性附景)DNA序列的测定GB 20554-2006 A. 1 测序样品顶处理.PCR扩增完毕，将样品置于一20.C条件下。随后除去矿物油，残留的部分用等体积的三氯甲皖抽提一两次。经纯化后，
11、获取纯化的DNAoA.2 洗脱:用洗脱液10mmol/L Tris和0.1mmol/L EDTA(pH 8.0日将纯化的DNA进行洗脱，然后克隆到pT7BlueT-vector中，PCR产物和载体的摩尔比为5: 1，所用的酶为高活性的T4连接酶，接着进行细菌转化。A.3 从含有合适插入片段的克隆中分离出质性DNA。A.4 用质位纯化试剂盒从细菌克隆中提取和纯化DNAoA.5 纯化后的DNA在DNA测序仪上采用Sanger双脱氧链终止法原理在两端同时进行测序。具体如下:A. 5. 1 设立双脱氧测序反应:引物，测序引物即为扩增引物。微量滴定板，为96孔U形微量滴定板。c) 链延伸一链终止反应呢合液的配置。A. 5.2 准备样品和列表，上样到微量滴定板中进行测序。A.6 测序条件:电压160V /cm，温度420C。根据凝脆的荧光放射自显影，运用计算机i卖取DNA编码。打印测试结果，然后进行数据处理。b) A.7 A.8 版权专有侵权必究中书号:155066 . 1-28577 定价:8.00元
