1、ICS 11 020C61 WS中 华 人 民 共 和 国 卫 生 行 业 标 准WS T633 2018巴贝虫检测虫种核酸鉴定法 Detectionof Babesia spp Identificationofspeciesbynucleicacidmethod 2018 09 26发布 2019 04 01实施中华人民共和国国家卫生健康委员会 发 布 WS T633 2018 I 前 言本标准按照GB T1 1 2009给出的规则起草 本标准由国家卫生标准委员会寄生虫病标准专业委员会提出 本标准起草单位 中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所 复旦大学 第二军医大学 本标准起草人 刘琴 周
2、晓农 张仪 胡薇 陈家旭 朱淮民 WS T633 2018 1 巴贝虫检测 虫种核酸鉴定法1 范围本标准规定了检测巴贝虫的虫种核酸鉴定法 本标准适用于各级疾病预防控制机构和医疗机构对巴贝虫的检测 2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件 仅所注日期的版本适用于本文件 凡是不注日期的引用文件 其最新版本 包括所有的修改单 适用于本文件 WS T 564 巴贝虫病诊断 3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件 3 1巴贝虫 Babesia spp 一类寄生于人和脊椎动物红细胞内的原虫 可引起巴贝虫病 babesiosis 感染人体的巴贝虫种类主要有田鼠巴贝虫 B
3、abesia microti 分歧巴贝虫 B divergens 邓肯巴贝虫 B duncani 和猎户巴贝虫 B venatorum 等 参见附录A 4 仪器和器材 4 1 高速离心机最大相对离心力为12 000 g 4 2 涡旋仪无级调速范围为200r min 3 000r min 4 3 PCR 扩增仪温度范围为4 99 温度精确为0 1 热盖为105 4 4 微波炉4 5 电泳仪电压为5 V 5 000V 电流为1 mA 500mA WS T633 2018 2 4 6 凝胶成像系统镜头分辨率 H V 为1 360 1 024 光源为透射UV 5 试剂和材料5 1 分子生物学试剂Taq
4、 酶 脱氧核糖核苷三磷酸 dNTPs 分子质量指示物及核酸提取试剂盒选用商品化产品 5 2 化学试剂Tris 乙酸电泳缓冲液 TAE 琼脂糖凝胶 6 加样缓冲液 参见附录B 5 3 引物 扩增巴贝虫 18S 核糖体RNA 18SrRNA 基因和转录间隔区 ITS 基因的特异性引物 见附录C 5 4 参照材料阳性对照为田鼠巴贝虫peabody mjr株基因组DNA 空白对照为去离子灭菌水 阴性对照为健康人全血基因组DNA 6 检测步骤6 1 样品 样品为临床诊断或疑似巴贝虫病病例抗凝血样品 6 2 虫种核酸鉴定6 2 1 核酸提取基因组DNA提取采用商品化全血DNA提取试剂盒 参见附录 B 6
5、2 2 18SrRNA基因扩增见附录C 6 2 3 ITS基因扩增见附录C 6 2 4 结果判定 6 2 4 1 电泳分析6 2 4 1 1 电泳 WS T633 2018 3 取第二轮PCR产物 5 L与 1 L 6 加样缓冲液混合 加样于含溴化乙锭替代物的 1 0 琼脂糖凝胶中 在1 TAE 缓冲液中 5 V cm 电泳约 40 min 当溴酚蓝到达底部时停止电泳 用凝胶成像系统或紫外分析仪分析 6 2 4 1 2 PCR结果判断6 2 4 1 2 1 PCR 扩增巴贝虫 18SrRNA基因 出现大小为 400bp 左右特异性的扩增片段 空白对照和阴性对照未出现条带 PCR结果阳性 PCR
6、 扩增巴贝虫 18SrRNA基因 未出现大小为 400 bp 左右特异性的扩增片段 空白对照和阴性对照未出现条带 PCR结果阴性 6 2 4 1 2 2 PCR扩增巴贝虫ITS基因 出现大小在 700bp 2 100bp 的特异性的扩增片段 空白对照和阴性对照未出现条带 PCR结果阳性 PCR扩增巴贝虫ITS基因 未出现特异性的扩增片段 空白对照和阴性对照未出现条带 PCR结果阴性 6 2 4 2 测序分析 阳性PCR扩增产物进行双向测序 将序列进行BLAST 比对分析 见附录C 6 2 4 3 虫种鉴定根据PCR扩增产物电泳结果与测序结果分析 综合判定虫种种类 见附录C WS T633 20
7、18 4 AA附 录 A 资料性附录 病原生物学A 1 分类巴贝虫 Babesia spp 属于顶复门 Apicomplexa 孢子虫纲 Sporozoa 梨形虫亚纲 Piroplasmasina 梨形虫目 Piroplasmida 巴贝虫科 Babesiidae 的巴贝虫属 Babesia 目前已鉴定的有100多种巴贝虫 可以感染牛 马 羊 犬等多种哺乳动物和鸟类 在100多种巴贝虫中 既往已知可以感染人的巴贝虫种类主要有 田鼠巴贝虫 B microti 分歧巴贝虫 B divergens 邓肯巴 贝虫 B duncani 也称为WA1 和猎户巴贝虫 B venatorum 也被称为EU1
8、等 不同巴贝虫虫种引起人体临床症状的比较见表A 1 A 2 分布本病呈地方性流行 在美国 巴贝虫病病例主要发现于马萨诸赛岛 纽约州 康涅狄格岛 加利福尼亚州以及罗得岛 在欧洲 法国 葡萄牙 意大利 波兰 挪威等地均有人巴贝虫病病例发生 另外 在埃及 墨西哥 澳大利亚 日本 韩国 巴基斯坦及南非也均有人巴贝虫病病例报道 在我国云南 河南 新疆 山东 陕西 浙江 江苏 广西 福建及台湾 香港地区等地均有人巴贝虫病病例报道 表A 1 不同巴贝虫虫种引起人体临床症状的比较 虫种 地理分布 媒介名称 潜伏期 临床特征 其他田鼠巴贝虫 B microti 欧洲 美国 日本 中国 埃及等 肩突硬蜱 卵形硬蜱
9、 全沟硬蜱 丹敏硬蜱 1周 6周 甚至3个月以上 大多数患者症状比较轻微 只出现一过性的发热症状 而重症患者出现疟疾样症状 包括发热 寒战 肌肉疼痛 贫血 无力 肝脾肿大 溶血性贫血等 一般以50岁以上的老人易感分歧巴贝虫 B divergens 欧洲 篦子硬蜱 1周 3周 突然起病 血红蛋白尿 黄疸 休克样表现 脾脏切除和免疫缺陷者易感邓肯巴贝虫 B duncani 欧洲 美国等 丹敏硬蜱 肩突硬蜱 3周 2个月 发热 寒战 肌肉疼痛 贫血 无力 肝脾肿大 溶血性贫血 持续数周或更长 脾脏切除患者易感 易输血传播猎户巴贝虫 B venatorum 欧洲 中国等 蓖子硬蜱 卵形硬蜱 不明确 大
10、多数患者症状比较轻微 只出现一过性的发热症状 严重者表现贫血 血红蛋白尿 黄疸等症状 免疫功能低下者或者脾切除患者易感 WS T633 2018 5 BB附 录 B 资料性附录 试剂配制B 1 试剂的配制B 1 1 Tris 乙酸电泳缓冲液 Tris acetic acid buffer solution TAE 的配制50 TAE 的配制 三 羟甲基 氨基甲烷 Tris 碱 242g 冰乙酸 57 1mL 0 5 mol L EDTA pH8 0 100mL 加去离子灭菌水定容至 1000 mL 混匀 4 保存备用 B 1 2 1 TAE 使用液的配制50 TAE 20 mL加蒸馏水定容至
11、1 000mL 混匀备用 B 1 3 1 0 琼脂糖凝胶的配制琼脂糖 1 0 g 加1 TAE 定容至 100 mL 微波炉加热完全融化后 溶液冷却至 60 加 10mg mL 溴化乙锭替代物 5 L 终浓度0 5 g mL 轻轻混匀后 制备凝胶 B 1 4 6 加样缓冲液的配制溴酚蓝 0 25g 蔗糖 40g 加蒸馏水至 100mL 置于 4 保存备用 B 2 DNA的提取 取 100 L血液样品 用商品化的全血样品DNA提取试剂盒提取基因组DNA 操作步骤按试剂盒说明书进行 WS T633 2018 6 CC附 录 C 规范性附录 PCR实验 测序结果分析及标准参考序列C 1 PCR扩增引
12、物序列巴贝虫虫种鉴定引物见表C 1 表C 1巴贝虫虫种鉴定引物 引物 引物名称 引物序列a 片段大小b 参考文献18S rRNA外侧引物 Bab 5 5 AATTACCCAATCCTGACACAGG 3 400 bp左右 3 Bab 8 5 TTTCGCAGTAGTTCGTCTTTAACA 3 18S rRNA内侧引物 Bab 6 5 GACACAGGGAGGTAGTGACAAGA 3 Bab 7 5 CCCAACTGCTCCTATTAACCATTAC 3 ITS外侧引物 ITS F3 5 GGTGGTGCATGGCCG 3 700bp 2100bp 4 ITS R3 5 T A T GCGC
13、TTCAATCCC 3 ITS内侧引物 ITS F4 5 GAGAAGTCGTAACAAGGTTTCCG 3 ITS R4 5 GCTTCACTCGCCGTTACTAGG 3 a18S rRNA基因引物序列和PCR反应引自WS T 564 b不同虫种片段大小不同 C 2 引物配制引物用去离子灭菌水配制成100 mol L储备液 然后取出一部分 加入相应体积的去离子灭菌水稀释成20 mol L的工作液备用 C 3 18S rRNA PCR反应体系及反应条件 C 3 1 18S rRNA PCR第一轮反应C 3 1 1以引物Bab 5和Bab 8进行第一轮扩增 反应体系为 50 L Taq 酶 5
14、 U L 0 25 L10 PCR缓冲液 含15mmol L Mg2 5 L25mmol L dNTPs 4 L20 mol L Bab 5 1 5 L WS T633 2018 7 20 mol L Bab 8 1 5 L基因组DNA模板 约70 ng 2 L去离子灭菌水 35 75 L总计 50 LPCR 反应需设立阳性 阴性和空白对照 C 3 1 2 PCR 条件95 5 min 95 45s 55 45s 72 1min 共35个循环 72 7 min 4 C 3 2 18S rRNA PCR第二轮反应C 3 2 1取第一轮PCR产物2 L为模板 以引物Bab6和Bab7进行第二轮扩增
15、 反应体系为 50 L Taq 酶 5U L 0 25 L10 PCR缓冲液 含15 mmol L Mg 2 5 L25mmol LdNTPs 4 L20 mol LBab6 1 5 L20 mol LBab7 1 5 L第一轮PCR产物 2 L去离子灭菌水 35 75 L总计 50 LC 3 2 2PCR 条件95 5 min 94 45s 55 45s 72 1 min 共35个循环 72 7min 4 C 4 ITS PCR反应体系及反应条件 C 4 1 ITS PCR第一轮反应C 4 1 1以引物ITS F3和ITS R3进行第一轮扩增 反应体系为 50 L Taq 酶 5U L 0
16、25 L10 PCR 缓冲液 含15mmol L Mg2 5 L25mmol L dNTPs 4 L20 mol L ITS F3 1 5 L20 mol L ITS R3 1 5 L基因组DNA模板 约70ng 2 L去离子灭菌水 35 75 L总计 50 LPCR 反应需设立阳性 阴性和空白对照 C 4 1 2 PCR条件95 5 min 94 30s 50 30s 72 2min 共35个循环 72 10 min 4 C 4 2 ITS PCR第二轮反应C 4 2 1取第一轮PCR产物 2 L为模板 以引物ITS F4和ITS R4进行第二轮扩增 反应体系为 50 L WS T633 2
17、018 8 Taq 酶 5U L 0 25 L10 PCR缓冲液 含15mmol L Mg2 5 L25mmol L dNTPs 4 L20 mol L ITS F4 1 5 L20 mol L ITS R4 1 5 L第一轮PCR产物 2 L去离子灭菌水 35 75 L总计 50 LC 4 2 2 PCR 条件95 5 min 94 30s 60 30s 72 2min 共35个循环 72 10 min 4 注 PCR实验符合WS T 230的规定 C 5 测序结果分析 序列同源性分析利用Blastn https blast ncbi nlm nih gov Blast cgi PROGRA
18、M blastn PAGE TYPE BlastSearch LINK LOC blasthome 根据序列的相似度 判断样本所扩增序列的巴贝虫种类 a 18SrRNA 基因序列与GenBank中巴贝虫18SrRNA序列相似度96 以上 或是 ITS 基因序列与GenBank中ITS 序列相似度95 以上 判定为巴贝虫 b 18S rRNA 基因序列与田鼠巴贝虫18SrRNA序列相似度99 以上 或是 ITS 基因序列与田鼠巴贝虫ITS 序列相似度 98 以上 判定为田鼠巴贝虫 c 18SrRNA 基因序列与分歧巴贝虫18SrRNA序列相似度99 以上 或是 ITS 基因序列与分歧巴贝虫ITS
19、 序列相似度98 以上 判定为分歧巴贝虫 d 18SrRNA 基因序列与邓肯巴贝虫18SrRNA序列相似度99 以上 判定为邓肯巴贝虫 e 18SrRNA 基因序列与猎户巴贝虫18S rRNA序列相似度99 以上 判定为猎户巴贝虫 C 6 标准参考序列 C 6 1 18S rRNA 标准参考序列C 6 1 1 田鼠巴贝虫18S rRNA 基因参考序列 参考序列GenBank序列号为 KU204794 其在该基因中起始位置为405 811 GACACAGGGAGGTAGTGACAAGAAATAACAATACAGGGCTTAAAGTCTTGTAATTGGAATGATGGGAATCTAAACCCTT
20、CCCAGAGTATCAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAAGTTGTTGCAGTTAAGAAGCTCGTAGTTGAATTTCTGCCTTGTCATTAATCTCGCTTCCGAGCGTTTTTTTATTGACTTGGCATCTTCTGGATTTGGTGCCTTCGGGTACTATTTTCCAGGATTTACTTTGAGAAAACTAGAGTGTTTCAAACAGGCATTCGCCTTGAATACTACAGCATGGAATAATGAAGTAGGACTTTGGTTCTATTTTGTTGGTTATTGAGCC
21、AGAGTAATGGTTAATAGGAGCAGTTGGG 407bp C 6 1 2 分歧巴贝虫18S rRNA 基因参考序列 参考序列GenBank序列号为 KP745627 其在该基因中起始位置为347 725 GACACAGGGAGGTAGTGACAAGAAATAACAATACAGGGCAATTGTCTTGTAATTGGAATGATGGTGACCTAAACCCTCACCAGAGTAACAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAACTTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGAATTTTTGCGTG
22、GTGTTAATATTGACTAATGTCGAGATTGCACTTCG WS T633 2018 9 CTTTTGGGATTTATCCCTTTTTACTTTGAGAAAATTAGAGTGTTTCAAGCAGACTTTTGTCTTGAATACTTCAGCATGGAATAATAGAGTAGGACTTTGGTTCTATTTTGTTGGTTTGTGAACCTTAGTAATGGTTAATAGGAACGGTTGGG 379bp C 6 1 3 邓肯巴贝虫18S rRNA 基因参考序列 参考序列GenBank序列号为 HQ289870 其在该基因中起始位置为445 842 GACACCGTGAGGTAGTG
23、ACAAGAAATAACAATACAGGGCTTAAAGCTTTGTAATTGGAATGATGGGAATCCAAACCCCTTCCAGAGTATCAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAACTTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGAACTTCTGCCGCTTGGCCTTCGTTCCCCTTGGGGTTTCGTTCGCCTGGTGGCTTACCTCTGGCGGTGGTTCTCCATTTGCCAGTTTTACTTTGAGAAAATTAGAGTGTTTCAAGCAGGCTTTTGCCTTGAATACTT
24、CAGCATGGAATAATAAAGTAGGACTTTGGTTCTATTTTGTTGGTTTCAGGACCAAAGTAATGGTT AATAGGAACAGTTGGG 398bp C 6 1 4 猎户巴贝虫18S rRNA基因参考序列 参考序列GenBank序列号为 KF724377 其在该基因中起始位置为423 801 GACACAGGGAGGTAGTGACAAGAAATAACAATACAGGGCAATTGTCTTGTAAATGGAATGATGGTGACCTAAACCCTCACCAGAGTAACAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAAT
25、AGCGTATATTAAACTTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGAATTTCTGCGTTATCGAGTTATTGACTCTTGTCTTTAATCGATTTCGCTTTTGGGATTTATCCCTTTTTACTTTGAGAAAATTAGAGTGTTTCAAGCAGACTTTTGTCTTGAATACTTCAGCATGGAATAATAGAGTAGGACTTTGGTTCTATTTTGTTGGTTTTTGAACCTTAGTAATGGTTAATAGGAACGGTTGGG 379bp C 6 2 ITS标准参考序列C 6 2 1 田鼠巴贝虫ITS 标准参考序列 参考序列GenBank序列号
26、为 AF510198 其在该基因中起始位 置为1 828 TTAAAGGAAGGAGAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTCTTATTAGAATTCTATGTATCCGTTTGGGTACGCTGGCCCGTGCGCTTGGTCGCACCTTTTATAGTAGTGGCCTTGGACGTAGCGGCTGCAACTTGTTGGAGCCGCATCCCCGTGGTGGCACAACGCGTCGGAAGGCGGGTTTGTCCGCTATGGGGCGTTCTCACTCCCAAGGTATTTTCCCCGGGCCTCTGTGTTAGATCATTCTAACGGGC
27、TTGGGGGCTATACTGTCATTCGCTGAGAAGTGCCCCCGTGGCTTTCTTGGCTGCTAACGTGGCTTTTCTCGGAAGGTCATGAGGAGCGATTTGTCTAACAACTACTACGAATATTAAACGAAACAAATTTTCAGCGGTGGATGTCTCGGCTCACACAACGATGAAGGACGCAGCGAAGTGCGATAATCATTGTGAATTGCAGAATTTAGCAAATCAACAGGTTTCTGAATGTATTGTACACACTGCCTCTGTTCGCAAGCAGTGCACCCATTTCAGCGCCTCTTAAAATCCTAAAGTATA
28、CCTTTTTCCAAGTATGCTTTGTGAGTGGTGCGCAACAGATTTTCTGTGTGTGCATTTAAGTTGGTGTGACTAGACGCGTTTATCACGCAGAAGGTTCTTTGAAACTTGGACTTGTTTGTGTGGT AGATAGTTTAGTTAGTAGCCGCGGCGTAGAGAATACGTTGCTGATGTTTTTATGGCCTGAAATTGGATGTGATGATCCGCTGAATTTAAGCATATAACTAAGCGGAAGAAAAGAAAATAACAATGATTCCCCT 828bp C 6 2 2 分歧巴贝虫ITS 标准参考序列 参考序列GenBank
29、序列号为 EU185801 其在该基因中起始位置为1 1044 GGACCGTGGCCTTTCCGATTCGTCGGCTTGGCCTAGGGAAGTCTTGTGAACCTTATCACTTAAAGGAAGGAGAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTCACATTGAATACCCTTGCACAATAGTGCTCGGCTTCGGCATTTACGTTGTGTAAGCTTGCTTGCAGCTGTGACTCTACGTCATGGTCCACTTTTGGTGGTTTCGTATTTGTC WS T633 2018 10 GTTGCCMTGGCGACGTGGTTTC
30、GGTCTTGTTCCGTTTCCATCCCTGCGCTTTTGCGTGGGACGTTGCCCCCTCCCACCCCACCGGGTGTATGTTTACTGCGGTGTAACTACTGTAGTTGGCGTACACTTGGGTTATGCCGTGTCGATACTGATGTTACTAGTGATTGCTCTTTGAGTGGTTGTTAGTGCTACAGTGTTGTCACGGATGCTGCTCGTGGATCTAATAGATTCAAGCAGTTGCTGCTTCGTGCAGTGTTTTGCGTAGCGATTTCGTTACGATAATGCAACTCCGCTCGTTCATCGTCTTGCGTTGTTCGAGTTT
31、GTTTAGAAATTATAAACTTTCAGCGATGGATGTCTTGGCTCACACAACGATGAAGGACGCAGCAAATTGCGATAAGCATTATGACTTGCAGACTTCTGCGATTTAACAGACCTCTGAACGTAACAAACACACCGCCTCTGCTCGCATGCGGTACTCCCGTTTCAGTGAGCCCCCTTTCCTAAAGGAACCACACTTTTACTCCTGGTAATAGTATGGTTAGTCCTTTGCGAGTGGGTGTTGTGACAATCACCTTAATTTCCATAGCATGCTMCCGGGTATCGCCACGTGTGATCTCGAAGC
32、TTCTTGTTGTAATTTATTACTCTAGGCTTCTTTTGAGATGTGCGGCTAGGAATTACTATTGCAGTATTTCTATAGCAAGTGGATGATGCTAGTGTTGTCAGTGCTATAAGTTTTGAATATCGCTCCTGAAATCGGGTGAGGCTATCCGCTGAATTTAAGCATATAATTAAGCGGCAGAAAAGAAAATAACTAT 1044bp C 7 巴贝虫PCR电泳结果图 图C 1巴贝虫临床样品18SrRNAPCR电泳结果图 1 阳性对照样品 2 3 河南田鼠巴贝虫病病例样品 4 5 浙江 云南田鼠巴贝虫病病例样品 6 7 阴性对照和空
33、白对照样品 图C 2巴贝虫临床样品ITSPCR电泳结果图 1 阳性对照样品 2 3 河南田鼠巴贝虫病病例样品 4 5 浙江 云南田鼠巴贝虫病病例样品 6 7 阴性对照和空白对照样品 WS T633 2018 11 参 考 文 献 1 陈小光 李学荣 吴忠道 巴贝虫和巴贝虫病的研究进展 J 国际医学寄生虫病杂志 2012 39 1 45 49 2 吴观陵 人体寄生虫学 第4版 M 北京 人民卫生出版社 2013 233 237 3 Wei Q Tsuji M Zamotoet A et al Human babesiosis in Japan isolation of Babesia micro
34、ti likeparasites from an asymptomatic transfusion donor and from a rodent from an area where babesiosis is endemic J Journal ofClinical Microbiology 2001 39 2178 2183 4 Holman P Swift P Frey R et al Genotypically unique Babesia spp isolated from reindeer Rangifertarandustarandus in the United States J Parasitology research 2002 88 405 411 5 白海鹏 孙维敏 任仟 等 我国巴贝虫病研究进展 J 哈尔滨师范大学自然科学学报 2014 30 5 100 102
