1、ICS 11 020C61 WS中 华 人 民 共 和 国 卫 生 行 业 标 准WS T632 2018巴贝虫检测血涂片镜检法 Detectionof Babesia spp Blood smearmicroscopyexaminationmethod 2018 09 26发布 2019 04 01实施中华人民共和国国家卫生健康委员会 发 布 WS T632 2018 I 前 言本标准按照GB T 1 1 2009给出的规则起草 本标准由国家卫生标准委员会寄生虫病标准专业委员会提出 本标准起草单位 中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所 第二军医大学 中国农业科学院上海兽医研究所 本标准起草
2、人 张仪 周晓农 刘琴 陈韶红 朱淮民 周金林 WS T632 2018 1 巴贝虫检测 血涂片镜检法1 范围本标准规定了检测巴贝虫的血涂片镜检法 本标准适用于各级疾病预防控制机构和医疗机构对巴贝虫的检测 2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件 仅所注日期的版本适用于本文件 凡是不注日期的引用文件 其最新版本 包括所有的修改单 适用于本文件 WS T 569 疟原虫检测 血涂片镜检法 WS T 564 巴贝虫病诊断3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件 3 1巴贝虫 Babesia spp 一类寄生于人和脊椎动物红细胞内的原虫 可引起巴贝虫病 Babes
3、iosis 感染人体的巴贝虫有田鼠巴贝虫 Babesia microti 分歧巴贝虫 B divergens 邓肯巴贝虫 B duncani 和猎户巴贝虫 B venatorum 等 3 2血涂片 bloodsmears将血液涂制于载玻片上制成的涂片 分为厚血膜涂片和薄血膜涂片 4 仪器和器材4 1 光学显微镜 100 油镜 10 目镜 4 2 血涂片染色架4 3 血涂片干燥架4 4 玻片盒 4 5 染色盘和染色缸 WS T632 2018 2 4 6计数器5 试剂和材料5 1 吉氏染色原液 Giemsa 5 2 pH7 2磷酸盐缓冲液 PBS 5 3 标准级载玻片 洁净载玻片 或表面带正电荷
4、的粘附玻片 5 4 甲醇 分析纯 5 5 香柏油或专用浸油 折射率 1 5 5 6 二甲苯 分析纯 5 7甘油6 检测步骤6 1 血涂片的制作6 1 1 采血部位及取血方法末梢 无名指指尖或耳垂 取血 用75 酒精棉球消毒取血部位 待酒精挥发后 用拇指和食指紧捏耳垂上方或无名指指尖 另一只手手持一次性采血针迅速刺入皮肤 轻轻挤压出血 婴儿可从拇趾或足跟扎刺取血 6 1 2 厚血膜制作取 1张已消毒的载玻片 或粘附玻片 作推片 用推片的一角 取 4 L 5 L的血量 使血与另 1 张平置的载玻片 或粘附玻片 中央偏右的位置接触 由里向外旋转 画 2 圈 4 圈 涂成直径 0 8cm 1cm大小圆
5、形厚血膜 见附录A 6 1 3 薄血膜制作干棉球抹净推片下角的血渍 用同一张推片中部取约 1 L 1 5 L的血量 将血置于离厚血膜左边缘约 0 3cm 的位置 推片的边缘紧贴载玻片 上下轻轻移动 使血沿推片的边缘散开至 2cm宽 使两张玻片保持 25 35 角 从右向左迅速推动推片向前 推成舌状薄血膜 见附录A 6 1 4 编号血涂片制好后水平放置 充分干燥后 在玻片一侧毛玻璃上或在靠近厚血膜一端边上标注编号和日期 6 2 固定与溶血 6 2 1 薄血膜固定将薄血膜一端朝下呈 45 角 用一次性吸管吸取甲醇溶液 均匀轻抹于薄血膜表面 避免碰触厚血膜 WS T632 2018 3 6 2 2
6、厚血膜溶血在干燥的厚血膜上滴加蒸馏水数滴 完全覆盖血膜 溶血数分钟 待血膜呈浅灰色 倾去溶血血液 6 3 吉氏染色6 3 1 吉氏染液的配制常用的吉氏染液工作液包括 2 3 10 三种浓度 分别由吉氏染液原液和pH 7 2磷酸盐缓冲液 PBS 按比例配制 也可购买商品化吉氏染液原液加实验用纯水按比例配制 见附录 B 6 3 2吉氏染色染色方法见附录B6 4 显微镜检查 在染色后的血涂片上加 1滴香柏油或专用浸油 用 100 倍 油镜 10 倍 目镜的光学显微镜检查 观察血片路线顺序为薄血膜从尾部舌尖部分开始 厚血膜从上端或下端开始 见附录A 6 5 结果判定6 5 1 巴贝虫检测阳性血膜中发现
7、巴贝虫判定为阳性 参见附录C 6 5 2 巴贝虫染虫率计数6 5 2 1 薄血膜的巴贝虫染虫率计数法显微镜下检查薄血膜 计数每个视野中的染虫红细胞和红细胞总数 2 000 个以上 用下式计算巴贝虫染虫率 巴贝虫染虫率 红细胞总数染虫红细胞 100 6 5 2 2 厚血膜的巴贝虫染虫率计数法若染虫率低于 0 1 时 显微镜下检查整张厚血膜片 计数整张厚血膜片的巴贝虫虫体数和红细胞总数 用下式计算巴贝虫染虫率 巴贝虫染虫率 100 红细胞数男性按 500万个 L血 女性按 450万个 L血计算 WS T632 2018 4 A附录A 规范性附录 操作示意图 图 A 1厚薄血膜血涂片的制作过程示意图
8、 WS T632 2018 5 图 A 2厚薄血膜血涂片的制作示意图图A 3厚薄血膜血涂片的读片示意图 A WS T632 2018 6 BB附录B 规范性附录 试剂配制与血涂片染色 保存方法B 1吉氏染色原液配制将 5 0g吉氏粉置于研钵中 加入少量甘油充分研磨 然后边加边磨 至 250 mL甘油加完为止 倒入500 mL有塞深色玻璃瓶中 在研钵中加入少量甲醇 洗掉剩余部分 倒入瓶内 再次加甲醇 洗后再倒入瓶中 至250mL甲醇洗净研钵中甘油为止 置室温内 避免阳光直射 塞紧瓶塞 避免蒸发和高湿造成的氧化 每天用力摇动溶液5 min 3 d后即可使用 储存时间越久染色效果越佳 根据日 常的需
9、求 用干燥吸管吸取少量的染色原液到密闭的分装瓶中 大约25 mL 切勿向原液中加入水 B 2pH7 2磷酸盐缓冲液 PBS 的配制称量 8 0 g NaCl 0 2 g KCl 0 24 g KH2PO4 或者 1 44g Na2HPO4 和1 8 g K2HPO4 溶于800 ml 蒸馏水中 用HCl调节溶液的 pH值至7 2 最后加蒸馏水定容至1 L 保存于4 冰箱中备用 B 3吉氏染色工作液配制B 3 12 吉氏染液工作液的配制在 98 mL pH 7 2 磷酸盐缓冲液中加入 2 mL吉氏染色原液并混匀 或 98mL实验用纯水中加入 2mL商品吉氏染色原液并混匀 B 3 23 吉氏染液工
10、作液的配制 在 97 mL pH 7 2 磷酸盐缓冲液中加入 3 mL吉氏染色原液并混匀 或 97mL实验用纯水中加入 3mL商品吉氏染液原液并混匀 B 3 310 吉氏染液工作液的配制在 90 mL pH 7 2 磷酸盐缓冲液中加入 10 mL吉氏染色原液并混匀 或 90 mL实验用纯水中加入10mL商品吉氏染液原液并混匀 B 3 4 注意事项吸取吉氏染色原液时切勿摇晃盛染色原液瓶子 吉氏染色工作液应现用现配 切勿将未用完的吉氏染色工作液倒回原液瓶中 B 4 单张血涂片染色法 单张血涂片吉氏染色常用于临床巴贝虫病患者的巴贝虫显微镜检测 采用 3 吉氏染液染色 30min或更长时间 该染色法染
11、色的血涂片可长期保存 也可采用 10 吉氏染液染色 8 min 10min 但该染色法染色的血涂片不适合长期保存 B 4 1 3 吉氏染液染色法 WS T632 2018 7 B 4 1 1 把经甲醇固定的薄血膜涂片充分干燥后 血膜面朝上水平放置在染色盘中 B 4 1 2 用吸管吸取新配制的 3 吉氏染液 3mL 左右 滴加于厚 薄血膜上 至染液均匀覆盖血膜 不溢出为止 B 4 1 3 静置染色约 30min B 4 1 4 将染色盘移至冲水池 用缓慢流水沿血涂片上缘冲洗 1min B 4 1 5 将染色后的血涂片血膜面朝下插入血片干燥架 晾干 B 4 2 10 吉氏染液快速染色法B 4 2
12、1 把经甲醇固定的薄血膜涂片充分干燥后 血膜面朝上水平放置在染色盘上 B 4 2 2 用吸管吸取新配制的 10 吉氏染液约 3 mL 滴加于厚 薄血膜上 至染液均匀覆盖血膜 不溢出为止 B 4 2 3 静置染色 8 min 10min B 4 2 4 将染色盘移至冲水池 沿血涂片上缘用缓慢流水冲洗 1min B 4 2 5 将染色后的血涂片血膜面朝下插入血片干燥架 晾干 B 5 成批血涂片染色成批血涂片染色常用于人群流行病学调查中的巴贝虫显微镜检测 一般采用 2 吉氏染液进行批量血涂片染色 B 5 1 将每张血涂片的血膜朝一个方向插入染色缸中 或将每对血涂片的血膜朝外插入染色缸中 B 5 2
13、倒入新配制的 2 吉氏染液浸没厚 薄血膜 B 5 3 静置染色 30min以上 B 5 4 向染色缸中注入自来水至溢出 除去染液表面浮渣 将染色缸中残余的染液倾出 加入自来水 缓慢冲洗 2次 3 次 B 5 5 取出血涂片 血膜面朝下插入血片干燥架 晾干 B 6 血涂片保存用吸水纸吸去已检血涂片血膜表面的香柏油 在血膜上滴加 2 滴 3 滴二甲苯 然后用吸水纸吸干 置血涂片于玻片盒内 避光 干燥和阴凉保存 以备复核 注意 专用浸油无需用二甲苯清洗 可直接用吸水纸吸干 WS T632 2018 8 CC附录C 资料性附录 形态学C 1形态巴贝虫在红细胞内寄生时形态具有多样性 常见虫体形态有环形
14、圆形 杆形 点状 梨形 阿米巴形等 典型形态为梨形 往往在一个红细胞内有多个虫体寄生 以 1个 4个虫体居多 可形成三联体或四联体型 即马尔他十字形 且可为不同发育时期的虫体 经吉氏染色后 胞浆呈蓝色 核呈紫红色 图C 1 薄血膜片中田鼠巴贝虫图C 2 薄血膜片中分歧巴贝虫 引自M rchK HolmaasG Frolander etal Severehuman Babesia divergens infectionin Norway IntJInfectDis 2015 33 37 38 WS T632 2018 9 图C 3 薄血膜片中邓肯巴贝虫 图C 4 薄血膜片中猎户巴贝虫 引自Sun
15、Y LiSG JiangJF etal Babesia venatorum InfectioninChild China Emerg InfectDis 2014 20 5 896 897 WS T632 2018 10 参 考 文 献 1 刘恩勇 赵俊龙 巴贝斯虫病 第一版 M 武汉 湖北人民出版社 2001 21 30 2 吴观陵 人体寄生虫学 第4版 M 北京 人民卫生出版社 2013 233 237 3 WS T 569 疟原虫检测 血涂片镜检法 4 Zhou X Xia S Huang JL et al Human babesiosis an emerging tick borne
16、disease in the People sRepublicof China J Parasites Vectors 2014 7 509 5 M rch K Holmaas G Frolander et al Severe human Babesia divergens infection in Norway J Int JInfect Dis 2015 33 37 38 6 Sun Y Li SG Jiang JF et al Babesia venatorum Infection in Child China J Emerg Infect Dis 2014 20 5 896 897 7 WS T 564 巴贝虫病诊断
