1、ICS07.080A40中华人民共和国国家标准GB/T342652017Sanger法测序技术指南GuideforthemethodofSangersequencing2017-09-07发布2018-04-01实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会发布目 次前言引言1 范围12 规范性引用文件13 术语和定义14 缩略语25 原理26 主要仪器、设备27 Sanger法基因测序指标38 Sanger法基因测序方法49 Sanger法基因测序的应用5附录A(资料性附录) Sanger法测序原理示意图6附录B(资料性附录) 试剂及溶液配制7附录C(资料性附录) 测序反
2、应体系的配制8附录D(资料性附录) 扩增程序9附录E(资料性附录) 待测序产物纯化10参考文献11GB/T342652017前 言本标准按照GB/T1.12009给出的规则起草。本标准由全国生化检测标准化技术委员会(SAC/TC387)提出并归口。本标准起草单位:深圳华因康基因科技有限公司、深圳市华因康高通量生物技术研究院、广州康昕瑞基因健康科技有限公司、武汉康昕瑞基因健康科技有限公司、中国测试技术研究院、上海交通大学医学院附属瑞金医院、国家人类基因组南方研究中心、中国计量科学研究院、中山大学肿瘤防治中心。本标准主要起草人:盛司潼、谭辉彪、李花、曾涛、杨杰斌、周李华、张俊、王升跃、全灿、陈功。
3、GB/T342652017引 言基因测序方法是基因科技产业链的核心技术,其发展状况直接关系到生物产业的发展状况,对生物学、癌症攻克、遗传学、医药研制、药效分析、农业、新能源、国家民族战略安全和人类生命健康安全具有至关重要的支撑作用。基因测序技术在全球的发展非常迅速,目前实际应用最广泛的是Sanger测序方法,它是超高精度测序的黄金标准,是迄今为止唯一既能用于人类基因组提供从头测序,又能用于从头组装的技术。将Sanger测序方法标准化并加以推广应用,生物企业乃至整个国内行业就会获得一个绝好的技术规范和保护自我发展的壁垒,推动整个行业产业链的发展,提升整个行业的技术实力。早日实现Sanger测序方
4、法的标准化,将对我国基因生物检测产业这一战略性新兴产业的发展起到至关重要的促进作用。为了使Sanger测序方法更加规范,有效发挥其重要的科技支撑作用,有必要对其制定标准。由于Sanger测序方法并非单一技术,涉及到不同技术领域的结合,包括生物、化学、机械、数据处理等,因此本标准仅对Sanger法基因测序的术语、技术指标,以及所涉及的仪器设备、试剂、方法进行说明和规定。GB/T342652017Sanger法测序技术指南1 范围本标准规定了Sanger测序方法的术语和定义、缩略语、原理、主要仪器、设备、Sanger法基因测序指标、Sanger法基因测序方法、Sanger法基因测序的应用。本标准适
5、用于对动物组织、植物组织、血液、口腔黏膜、毛发、粪便、土壤、微生物等生物样品中的DNA通过Sanger测序方法进行测序。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1 基因测序 genesequencing对核酸分子的核苷酸排列顺序的测定,即测定组成核酸分子的腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)或者是尿嘧啶(U)的排列顺序。GB/T309892014,定义
6、3.183.2 Sanger测序方法 methodofSangersequencing用于基因测序的双脱氧链末端终止法,在链延伸过程中利用荧光标记双脱氧碱基随机阻断,产生以A、T、C、G结束的四组不同长度的核苷酸链,通过读取荧光信号实现对核酸碱基序列信息的读取。3.3 变性 denaturation蛋白质或核酸的二级或三级结构在物理或化学因素作用下被改变而导致其理化性质改变和生物活性丧失的现象。3.4 引物 primer在DNA复制过程中,结合于模板链上并作为复制延伸的起始位点和/或终止位点的,具有一定长度和顺序的寡核苷酸链。GB/T309892014,定义3.113.5 测序读长 readl
7、engthofgenesequencing测序能测得的最长基因片段的长度。注:通常以碱基数表示。1GB/T342652017GB/T309892014,定义3.243.6 QV值 qualityvalue用于表示测序结果准确质量的数值。注:QV10代表90%的准确度,QV20代表99%的准确度,QV30代表99.9%的准确度,QV40代表99.99%的准确度,QV50代表99.999%的准确度。3.7 不可信区域 unreliablearea测序结果序列两端QV值低而不作为结果分析的区域。4 缩略语下列缩略语适用于本文件。DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid)ddNT
8、P:双脱氧核糖核苷三磷酸(doubledeoxy-ribonucleosidetriphosphate)dNTP:脱氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleosidetriphosphate)EDTA:乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid)NaAc:醋酸钠(sodiumacetate)PCR:聚合酶链式反应(polymerasechainreaction)RNA:核糖核酸(ribonucleicacid)5 原理5.1 碱基互补配对原理在DNA分子结构中,碱基之间的氢键具有固定的数目,且DNA两条链之间的距离保持不变。DNA分子结构中的4种碱基之间
9、的配对遵循一定的规律,即A仅与T配对,G仅与C配对,反之亦然。腺嘌呤与胸腺嘧啶之间有两个氢键,鸟嘌呤与胞嘧啶之间有三个氢键,即A=T,GC。根据碱基互补配对的原则,一条链上的A的数量等于互补链上的T的数量;一条链上的G的数量等于互补链上的C的数量,反之亦然。5.2 Sanger法测序原理每一轮序列测定由一套四个单独的反应构成,每个反应含有所有四种dNTP,并混入少量一种ddNTP。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团,在DNA合成反应中不能形成磷酸二酯键,用来中断DNA合成反应,使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例的带有荧光同位素标
10、记的某种ddNTP,通过凝胶电泳和放射自显影,就可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列。Sanger法测序原理示意图参见附录A。6 主要仪器、设备6.1 电子天平,相关指标宜参照GB/T264972011。6.2 电泳装置,相关指标宜参照YY/T00872004。6.3 电泳凝胶成像系统。6.4 离心机,相关指标宜参照YY/T06572008。2GB/T3426520176.5 用于溶解电泳胶时进行加热的加热装置,最高温度可达到60。6.6 用于测定核酸浓度的设备,如分光光度计、核酸定量分析仪。6.7 PCR仪,相关指标宜参照YY/T11732010。6.8 基因测序仪。7 Sanger
11、法基因测序指标7.1 测序样品7.1.1 质粒样品质粒浓度宜大于或等于50ng/L,体积宜大于或等于10L,反应数增加时,所需的体积数宜相应增加;质粒样品宜溶于一级水,一级水应符合GB/T6682的要求;质粒纯化后的OD260nm/OD280nm值宜在1.6至2.0之间;推荐明确载体及预期插入目的片段的长度。7.1.2 纯化PCR产物纯化PCR产物在电泳检测中条带单一,并与目的片段大小一致;纯化PCR产物宜溶于一级水,纯化PCR产物的OD260nm/OD280nm值宜在1.6至2.0之间;PCR产物片段小于150bp时,建议对其进行克隆后再测序。7.1.3 未纯化PCR产物未纯化PCR产物在电
12、泳检测中可分辨出目的条带;PCR产物片段宜大于或等于200bp,若产物片段小于150bp时,建议对其进行克隆后再测序。7.2 测序引物测序引物宜在17bp至25bp之间,测序引物的Tm值宜在55至65之间;测序引物与待测样品之间宜仅有一个结合位点;测序引物建议避免形成引物二聚体、发卡结构或复杂二级结构;随机引物、兼并引物和混合引物不宜作为测序引物。7.3 测序模板用量纯化后PCR产物模板用量:a) 产物片段长度为100bp200bp时,用量宜为1ng3ng;b) 产物片段长度为200bp500bp时,用量宜为3ng10ng;c) 产物片段长度为500bp1000bp时,用量宜为5ng20ng;
13、d) 产物片段长度为1000bp2000bp时,用量宜为10ng40ng;e) 产物片段长度大于2000bp时,用量宜为20ng50ng。其他模板用量,质粒用量宜为100ng300ng;大分子量模板(如Cosmid、BAC)宜大于或等于0.5g;细菌基因组DNA宜大于或等于2g。7.4 反应体系按基因测序仪厂家说明书要求的配比配制反应体系。相关试剂及溶液的配制参见附录B。7.5 标记物标记物宜采用HEX、JOE、ROX、TET、TAMRA、FAM、LIZ、VIC、NED或PET,标记物激发波长3GB/T342652017宜为535nm、520nm、588nm、521nm、560nm、494nm
14、、638nm、538nm、546nm、558nm。7.6 测序结果7.6.1 测序读长当待测核酸片段长度超过所使用仪器有效读长时,测序读长宜达到所使用仪器的有效读长;当待测核酸片段序列长度小于所使用仪器的有效读长时,测序读长宜包括待测核酸片段序列全长。7.6.2 QV值可信区域的QV值建议达到QV20,QV=-10lgPe,Pe代表碱基读取的错误率,QV20表示99%准确率。8 Sanger法基因测序方法8.1 总则首先利用测序样品通过测序PCR反应获得待测序产物,然后对待测序产物进行纯化与变性后,将变性产物上样至基因测序仪中电泳,获得电泳图谱,经基因测序仪配套的数据分析系统对图谱进行分析后,
15、获得所测序列信息,并形成碱基序列输出。8.2 测序PCR反应8.2.1 配制反应体系按拟采用的Sanger基因测序仪的配套试剂要求的配比配制。测序反应体系的配制可参照附录C进行。8.2.2 PCR扩增程序根据待测样品的大小及测序引物Tm值,调整扩增程序,扩增程序中的退火温度宜在5055。扩增程序参见附录D。8.3 待测序产物纯化宜采用乙醇/EDTA/NaAc法对待测序产物进行纯化,让残余乙醇挥发干,每个样品加入10L甲酰胺。乙醇/EDTA/NaAc法参见附录E。8.4 待测序产物上样电泳8.4.1 毛细管灌胶安装毛细管并对其位置进行校正,然后通过人工手动或者由仪器自动对毛细管进行灌胶。8.4.
16、2 电进样及电泳毛细管和电极伸入样品溶液中,加上电压使得待测序产物中带负电的DNA分子进入毛细管,并在电场的作用下向阳极泳动。8.4.3 荧光激发及检测待测序产物中带有荧光标记的DNA片段按大小依次通过激光检测区,受激发出荧光,产生荧光信4GB/T342652017号并被荧光信号收集器收集,收集到的荧光信号将通过配套处理软件转换成电泳图谱。8.5 数据分析,序列输出通过配套的数据分析系统对图谱数据进行序列分析,得出所测基因序列信息,形成碱基序列输出。9 Sanger法基因测序的应用Sanger法测序技术可以应用在多个方面:DNA测序中的再测序,种属鉴定,基因型分析和基因突变检测,农牧业育种,遗
17、传病诊断,药物疗效和个体化差异的筛查,产前诊断,亲子鉴定。5GB/T342652017附 录 A(资料性附录)Sanger法测序原理示意图Sanger法测序原理如图A.1所示。图A.1 Sanger法测序原理示意图6GB/T342652017附 录 B(资料性附录)试剂及溶液配制B.1 乙醇醋酸钠混合物的配制将50mL无水乙醇与2mL的NaAc(3mol/L,pH5.2)、10mL一级水混匀即可。B.2 75%乙醇将75mL的无水乙醇加25mL的一级水混匀,存于-20。B.3 引物配制根据所需引物量,按下述配比进行稀释。10L10mol/L的引物加21.25L的一级水,混匀即得3.2mol/L
18、的引物。7GB/T342652017附 录 C(资料性附录)测序反应体系的配制C.1 相关试剂配制2.5BigDyeV3.1Mix的配制:将BigDyeV3.1Mix原管(10)解冻低速短暂离心,原液分装25L到1.5mL的Ep管中备用;然后在需使用的Ep管中,加入75L的一级水,震荡混匀即可得到2.5的BigDyeV3.1Mix。C.2 测序反应体系配制测序反应体系配制参照表C.1进行。表C.1 测序反应体系配制表试剂名称浓度体积/LBigDyeV3.1Mix2.54BigDyeSequencingBuffer5.02模板根据7.3的用量配制相应浓度1引物3.2mol/L1一级水加至总体积为
19、20L注:根据所需的反应体系大小,可在保证BigDye的终浓度为1的情况下,按上述配比进行相应调整。8GB/T342652017附 录 D(资料性附录)扩增程序根据待测样品的大小,以所选用基因测序仪的有效读长为分界点,分别选择相应的扩增程序进行扩增,程序如下:a) 一般测序961min;9610s,505s,604min;重复25个循环;4保温。b) 大分子测序955min;9630s,505510s,604min;重复50个循环;4保温。注:根据待测样品的实际大小、测序引物的Tm值,上述扩增程序中的延伸时间、退火温度可进行相应的调整。9GB/T342652017附 录 E(资料性附录)待测序
20、产物纯化待测序产物的纯化一般采用乙醇/EDTA/NaAc法纯化,步骤如下:a) 将测序PCR产物短时离心,从而将待测序产物转移至96孔板底部;b) 加乙醇醋酸钠混合物31L/反应,涡旋混匀4次以上,避光静置15min;c) 4、4000r/min离心30min,马上倒置96孔板,短时离心至转速达900r/min(约140g)时终止离心;d) 每反应加100L75%乙醇,4、4000r/min离心5min;然后马上倒置96孔板,短时离心至转速达900r/min(约140g)终止离心;e) 室温放置15min,每反应加10L甲酰胺,盖好,涡旋4次以上混匀,短暂离心,室温5min溶解;f) 如果不是
21、用测序96孔板纯化,则需将样本转移至测序96孔板,盖好。并对测序96孔板孔中对应的样本进行记录。注:可采用等效试剂盒进行纯化。01GB/T342652017参 考 文 献1 GB/T6379.12004 测量方法与结果的准确度(正确度与精密度) 第1部分:总则与定义2 GB/T264972011 电子天平3 GB/T309892014 高通量基因测序技术规程4 YY/T00872004 电泳装置5 YY/T06572008 医用离心机6 YY/T11732010 聚合酶链反应分析仪7 ISO5725-1:1994 Accuracy(truenessandprecision)ofmeasurem
22、entmethodsandresultsPart1:Generalprinciplesanddefinitions8 AppliedBiosystems3500Dx/3500xLDx基因分析仪用户指南9 AppliedBiosystems3500/3500XL遗传分析仪建议操作指南10 F.Sanger,S.NicklemandA.R.Coulson.DNAsequencingwithchain-terminatinginhibitorsJ.PNAS,1977,74,12:5463-5467.GB/T342652017710256243T/BG中华人民共和国国家标准Sanger法测序技术指南GB/T342652017*中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平里西街甲2号(100029)北京市西城区三里河北街16号(100045)网址:服务热线:400-168-00102017年9月第一版*书号:1550661-57415版权专有 侵权必究
