1、SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1447.1-2004猪传染性胸膜肺炎阻断酶联免疫吸附试验Blocking ELISA for infectious pleuropneumonia of swine2004-06-01发布2004-12-01实施中华人民共和匡国家质量监督检验检疫总I FRSN/T 1447.1-2004月U吕本标准的附录A为规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国上海出人境检验检疫局。本标准主要起草人:周以凤、李树清、胡永强、李健、王巧全。本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。SN/T 1447.1-200
2、4猪传染性胸膜肺炎阻断酶联免疫吸附试验范围本标准规定了阻断酶联免疫吸附试验检测猪传染性胸膜肺炎型特异性抗体的方法。本标准适用于猪传染性胸膜肺炎的检疫、流行病学调查、诊断和免疫监测2材料2.1试剂2.1.1磷酸氢二钠(Na_ HP0,12H20)。2. 1.2磷酸二氢钾(KH2P0,),2. 1.3氯化钠(NaCD.2. 1.4柠檬酸(C, Ha O,Hz0),2. 1.5邻苯二胺(OPD),2. 1.6 30%过氧化氢(H202)。2.1.7硫酸(H,SO,),2.1.8吐温-20 (Tween-20) ,2.1.9牛血清白蛋白(BSA).2.1.10包被液、稀释液、洗液、酶底物溶液和终止液的
3、配制见附录A,注:所有化学试剂均为分析纯.2.2仪器设备2.2.1 96孔酶标板。2.2.2多通道、单通道可调移液器及加样头。2.2.3玻璃试管。2.2.4试管架。2.2.5天平(0.000 1 g),2.2.6低速离心机。2.2.7酸度计。2.2.8酶标仪。2.2.9普通冰箱。2.2. 10恒温箱2.3标准试剂2.3. 1猪传染性胸膜肺炎标准抗原。2.3.2猪抗传染性胸膜肺炎标准阳性血清。2.3.3标准猪阴性血清。2.3.4兔抗猪传染性胸膜肺炎标准阳性血清。2.3.5辣根过氧化物酶标记的猪抗兔IgG,采样被检动物无菌采血5 mL，待血液凝固后，以2 000 r/min离心10 min，分离血
4、清，血清一20保存。1SN/T 1447.1-2004操作方法4.1包被抗原将猪传染性胸膜肺炎抗原用包被液稀释成工作浓度，包被酶标板，每孔100 hL，加盖后放置4冰箱过夜。4.2封闭次日取出酶标板，置37恒温箱或室温30 min后，弃去包被液，每孔加200 hL稀释液，37C孵育I h.4.3洗板取出酶标板弃去液体后，每孔加洗液300 I,L，洗板，共三次，每次2 min。最后一次倒置拍干。4.4加样被检血清用稀释液作1，4稀释，每份血清加2孔，每孔100 IL。设立下列对照:猪抗传染性胸膜肺炎标准阳性血清(阳性对照)、标准猪阴性血清(阴性对照)、兔抗猪传染性胸膜肺炎标准阳性血清(兔抗APP
5、对照)、空白对照。阳性、阴性血清对照同被检血清一样，用稀释液作1:4稀释，每个对照加2孔，每孔100 pL。兔抗APP对照和空白对照同样加两孔，每孔加100 hL稀释液，37作用1 h,4.5加免抗APP高免血清用稀释液将兔抗猪传染性胸膜肺炎标准阳性血清稀释成工作浓度，每孔1 00可，空白对照每孔加100 KL稀释液，37作用30 min,4.6洗板按4. 3操作。4.7加猪抗兔IgG一辣根过氧化物酶结合物用稀释液将酶结合物稀释成工作浓度，每孔100 KL,37作用1 h,4.8洗板按4.3操作。4.9加酶底物溶液每孔加100 pL,37作用20 min,4. 10终止反应取出反应板，每孔加5
6、0 IL终止液终止反应。4.11测吸光值用酶标仪在490 nm波长下，以空白对照为参照，测定其吸光值(OD) ,5数据计算5. 1计算平均吸光值:被检样品和各对照的两孔吸光值之和除以2,5.2计算相对平均吸光值:被检样品及对照均按式(1)计算相对平均吸光值:B.，n/乃=下了入1VV%0L。(1)式中:A相对平均吸光值;B样品(对照)平均吸光值;C标准阴性平均吸光值。6结果判定对照:阳性对照相对平均吸光值应小于20%，兔抗APP对照相对平均吸光值应大于40%。对照SN/T 1447.1-2004成立才能对样品进行判定。6.2阳性反应:被检血清相对平均吸光值小于20%e6.3疑似反应:被检血清相
7、对平均吸光值20%-40写，疑似反应的样品进行重复试验，若仍为疑似反应则判为阳性。6.4阴性反应:被检血清相对平均吸光值大于40%.SN/T 1447.1-2004附录A(规范性附录)试荆配制A. 1包被液(0. 01 mol/L pH 7. 2磷酸盐缓冲液，PBS)取23. 876 g磷酸氢二钠(Na, HPO,12H:0)溶解于少量的蒸馏水中，完全溶解后加蒸馏水定容至1 000 mL配制成1/15 mol/L磷酸氢二钠(Naz H PO,12H20).取9. 074 g磷酸二氢钾(KHzP0, )溶解于少量的蒸馏水中，完全溶解后加蒸馏水定容至1 000 mL配制成1八5 mol/L磷酸二氢
8、钾(KH2PO,).取8.5 g氯化钠(NaCl)溶解于少量的蒸馏水中，完全溶解后加蒸馏水定容至1 000 mL配制成生理盐水。取1/15 mol/L磷酸氢二钠(Nat HPO,12H,0)溶液73 mL,1/15 mol/L磷酸二氢钾(KH,P0,)溶液27 mL、生理盐水566 ml馄匀后，用1/15 mol/L磷酸盐调PH值至7. 2即成包被液。A. 2稀释液(PBS +T+ BSA)每100 mL 0. 01 mot/l. PH 7. 2 PBS溶液中加牛血清白蛋白(BSA)0.2 g-1 g，加50 pL吐温-20(0.05% Tween-20)，即成PBS+T+BSA稀释液。A.
9、3洗液(PBS +T)每100 mL 0. 01 mol/L PH 7.2 PBS溶液中加50 1L Tween-20，即成PBS+T洗液。A. 4酶底物溶液的配制取21 g柠檬酸(Cs Ha 0,H20)加蒸馏水溶解并定容至1 000 mL配制成0. 1 mol/L柠檬酸。取71. 6 g磷酸氢二钠(Naz HPO,12H20)加蒸馏水溶解并定容至1 000 mL配制成0. 2 mol/L磷酸氢二钠。取0. 1 mol/L柠檬酸24.3 mL,0.2 mol/L磷酸氢二钠25. 7 ml，两液混合后加人20 mg邻苯二胺，充分溶解，临用前加20 KL 30% HBO,，即成酶底物溶液。A. 5终止液(2 mol/L H2SO,)取分析纯硫酸(H2 S0, ) 22. 2 mL(含量95% -98%)缓慢加人到177. 8 mL蒸馏水中，混匀即成mol/L硫酸(H,SO)溶液。
