1、 Numro de rfrence ISO/TS 29843-1:2010(F) ISO 2010SPCIFICATION TECHNIQUE ISO/TS 29843-1 Premire dition 2010-10-01Qualit du sol Dtermination de la diversit microbienne du sol Partie 1: Mthode par analyse des acides gras phospholipidiques (PLFA) et par analyse des lipides ther phospholipidiques (PLEL)
2、Soil quality Determination of soil microbial diversity Part 1: Method by phospholipid fatty acid analysis (PLFA) and phospholipid ether lipids (PLEL) analysis ISO/TS 29843-1:2010(F) PDF Exonration de responsabilit Le prsent fichier PDF peut contenir des polices de caractres intgres. Conformment aux
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8、e ii ISO 2010 Tous droits rservsISO/TS 29843-1:2010(F) ISO 2010 Tous droits rservs iiiSommaire Page Avant-propos .iv Introduction.v 1 Domaine dapplication 1 2 Rfrences normatives.1 3 Termes abrgs .1 4 Principe.2 5 Ractifs et matriaux 3 5.1 Sol .3 5.2 Ractifs.3 5.3 Tampons et talons.4 5.4 Appareillag
9、e .4 6 Modes opratoires.5 6.1 Extraction des lipides (extraction de Bligh-Dyer) 5 6.2 Sparation des lipides par colonne SI 5 6.3 Analyse des PLFA .5 6.3.1 Hydrolyse alcaline douce .5 6.3.2 Colonne NH 2 : Sparation des FAME issus des FAME hydroxy-substitus (PLOH) et des lipides insaponifiables6 6.3.3
10、 Colonne SCX: Sparation des PLFA non substitus liaison ester (EL-PLFA).6 6.3.4 Mthylation acide des lipides insaponifiables et sparation en UNOH et UNSFA .6 6.3.5 Drivatisation des PLOH et UNOH au TMSI (voir 5.2.22) .6 6.3.6 Drivatisation des MUFA au DMDS (voir 5.2.8).7 6.4 Analyse des PLEL .7 6.4.1
11、 Gnralits .7 6.4.2 Mthylation acide 7 6.4.3 Clivage des liaisons ther avec de lacide iodhydrique (HI) .7 6.4.4 Dshalognation rductrice au zinc7 6.5 Mesurage des fractions de PLFA/PLEL 7 7 Identification et calcul.8 Bibliographie.9 ISO/TS 29843-1:2010(F) iv ISO 2010 Tous droits rservsAvant-propos LIS
12、O (Organisation internationale de normalisation) est une fdration mondiale dorganismes nationaux de normalisation (comits membres de lISO). Llaboration des Normes internationales est en gnral confie aux comits techniques de lISO. Chaque comit membre intress par une tude a le droit de faire partie du
13、 comit technique cr cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec lISO participent galement aux travaux. LISO collabore troitement avec la Commission lectrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation lectrotechnique. Le
14、s Normes internationales sont rdiges conformment aux rgles donnes dans les Directives ISO/CEI, Partie 2. La tche principale des comits techniques est dlaborer les Normes internationales. Les projets de Normes internationales adopts par les comits techniques sont soumis aux comits membres pour vote.
15、Leur publication comme Normes internationales requiert lapprobation de 75 % au moins des comits membres votants. Dans dautres circonstances, en particulier lorsquil existe une demande urgente du march, un comit technique peut dcider de publier dautres types de documents normatifs: une Spcification p
16、ubliquement disponible ISO (ISO/PAS) reprsente un accord entre les experts dans un groupe de travail ISO et est accepte pour publication si elle est approuve par plus de 50 % des membres votants du comit dont relve le groupe de travail; une Spcification technique ISO (ISO/TS) reprsente un accord ent
17、re les membres dun comit technique et est accepte pour publication si elle est approuve par 2/3 des membres votants du comit. Une ISO/PAS ou ISO/TS fait lobjet dun examen aprs trois ans afin de dcider si elle est confirme pour trois nouvelles annes, rvise pour devenir une Norme internationale, ou an
18、nule. Lorsquune ISO/PAS ou ISO/TS a t confirme, elle fait lobjet dun nouvel examen aprs trois ans qui dcidera soit de sa transformation en Norme internationale soit de son annulation. Lattention est appele sur le fait que certains des lments du prsent document peuvent faire lobjet de droits de propr
19、it intellectuelle ou de droits analogues. LISO ne saurait tre tenue pour responsable de ne pas avoir identifi de tels droits de proprit et averti de leur existence. LISO/TS 29843-1 a t labore par le comit technique ISO/TC 190, Qualit du sol, sous-comit SC 4, Mthodes biologiques. LISO/TS 29843 compre
20、nd les parties suivantes, prsentes sous le titre gnral Qualit du sol Dtermination de la diversit microbienne du sol: Partie 1: Mthode par analyse des acides gras phospholipidiques (PLFA) et par analyse des lipides ther phospholipidiques (PLEL) Partie 2: Mthode par analyse des acides gras phospholipi
21、diques (PLFA) en utilisant la mthode simple dextraction des PLFA ISO/TS 29843-1:2010(F) ISO 2010 Tous droits rservs vIntroduction Les phospholipides sont des composants essentiels des membranes de toutes les cellules vivantes, et leurs acides gras (PLFA: acides gras phospholipidiques) ou leurs chane
22、s latrales isoprniques liaison ther (PLEL: lipides ther phospholipidiques) permettent deffectuer une diffrenciation taxonomique dans des communauts microbiennes complexes (Rfrences 5 et 7). Cette approche est dsormais bien tablie dans le domaine de lcologie des sols et sert doutil phnotypique, et do
23、nc complmentaire, aux approches gnotypiques (gntique molculaire) pour dterminer la diversit microbienne. Il existe diffrentes mthodes de dosage des acides gras prsents dans le sol. Ces mthodes prsentent, lors de leur application, diffrents niveaux de complexit et permettent dobtenir diffrents niveau
24、x de rsolution concernant la description des communauts microbiennes du sol. Le dosage des PLFA et des PLEL totaux fournit une mesure quantitative de la biomasse viable du sol: les micro-organismes des trois domaines de la biosphre (bactries, champignons et archaebactries). Les microbes viables ont
25、une membrane intacte qui contient des phospholipides. Les enzymes cellulaires hydrolysent et librent le groupe phosphate dans les minutes, voire les heures suivant la mort cellulaire (Rfrence 6). En plus des descriptions taxonomiques, la technique PLFA permet de dterminer les modifications physiolog
26、iques au sein des consortiums microbiens. Par exemple, les PLFA mononiques 16:17c et 18:17c sont progressivement convertis en acides gras cyclopropyliques cy17:0 et cy19:0 dans les bactries Gram-ngatives en rponse aux contraintes environnementales (Rfrence 2). Il existe dautres mthodes de dosage des
27、 PLFA (Rfrences 3 et 6) en plus de la mthode dcrite dans la prsente partie de lISO/TS 29843. Avec ces mthodes, seuls les PLFA bactriens et fongiques peuvent tre estims. Il est impossible de doser les acides gras hydroxy-substitus (PLOH), les acides gras sans liaison ester (NEL) et les PLEL. SPCIFICA
28、TION TECHNIQUE ISO/TS 29843-1:2010(F) ISO 2010 Tous droits rservs 1Qualit du sol Dtermination de la diversit microbienne du sol Partie 1: Mthode par analyse des acides gras phospholipidiques (PLFA) et par analyse des lipides ther phospholipidiques (PLEL) 1 Domaine dapplication La prsente partie de l
29、ISO/TS 29843 spcifie une mthode tendue permettant dextraire et de doser les acides gras phospholipidiques (PLFA) et les lipides ther phospholipidiques (PLEL) du sol. LISO/TS 29843-2 spcifie une mthode simple permettant dextraire uniquement les PLFA du sol. 2 Rfrences normatives Les documents de rfre
30、nce suivants sont indispensables pour lapplication du prsent document. Pour les rfrences dates, seule ldition cite sapplique. Pour les rfrences non dates, la dernire dition du document de rfrence sapplique (y compris les ventuels amendements). ISO 10381-6, Qualit du sol chantillonnage Partie 6: Lign
31、es directrices pour la collecte, la manipulation et la conservation, dans des conditions arobies, de sols destins lvaluation en laboratoire des processus, de la biomasse et de la diversit microbiens 3 Termes abrgs FAME ester(s) mthylique(s) dacide gras (EL-)PLFA acide(s) gras phospholipidique(s) ( l
32、iaison ester) PLEL lipide(s) ther phospholipidique(s) SATFA acide(s) gras satur(s) MUFA acide(s) gras monoinsatur(s) PUFA acide(s) gras polyinsatur(s) PLOH acide(s) gras hydroxy-substitu(s) NEL-PLFA acide(s) gras phospholipidique(s) sans liaison ester UNSFA acide(s) gras non substitu(s) UNOH acide(s
33、) gras hydroxy-substitu(s) GC/MS chromatographie en phase gazeuse/spectromtrie de masse ISO/TS 29843-1:2010(F) 2 ISO 2010 Tous droits rservsSCX colonne changeuse de cations CLHP chromatographie liquide haute performance 4 Principe Les lipides sont extraits en appliquant le mode opratoire dextraction
34、 de Bligh et Dyer (Rfrence 9). Les extraits lipidiques sont spars par chromatographie en phase liquide en utilisant une colonne de silice (colonne SI). Les phospholipides sont transforms en esters mthyliques dacides gras (FAME) par hydrolyse alcaline douce et en lipides ther phospholipidiques (PLEL)
35、 par hydrolyse acide et mthylation. La sparation des FAME en acides gras saturs (SATFA), monoinsaturs (MUFA), polyinsaturs (PUFA), hydroxy- substitus (PLOH), non substitus sans liaison ester (NEL-UNSFA) et hydroxy-substitus sans liaison ester (NEL-UNOH) est effectue sur des colonnes dextraction en p
36、hase solide. Les diffrents FAME sont mesurs par chromatographie en phase gazeuse/spectromtrie de masse (GC/MS). Une vue densemble schmatique des modes opratoires est illustre la Figure 1. Figure 1 Vue densemble schmatique de lanalyse des PLFA et des PLEL ISO/TS 29843-1:2010(F) ISO 2010 Tous droits r
37、servs 35 Ractifs et matriaux 5.1 Sol Prlever des chantillons de sol et les prparer conformment lISO 10381-6. Si les chantillons tamiss ltat frais ne sont pas analyss immdiatement, ils peuvent tre conservs 20 C ou stocks dans du chloroforme aprs extraction des lipides (voir 6.1). 5.2 Ractifs Au cours
38、 de lanalyse, sauf indication contraire, utiliser uniquement des ractifs de qualit analytique reconnue. 5.2.1 Actone, C 3 H 6 O, pour lanalyse des rsidus. 5.2.2 Actonitrile, CH 3 CN, pour chromatographie liquide haute performance (CLHP). 5.2.3 Bis(trimthylsilyl)trifluoroactamide (BSTFA). 5.2.4 Celit
39、e 545 1) , granulomtrie de 0,02 mm 0,10 mm. 5.2.5 Chloroforme, CHCl 3 . 5.2.6 Dichloromthane, CH 2 Cl 2 , pour lanalyse des rsidus. 5.2.7 ther dithylique, (C 2 H 5 ) 2 O. 5.2.8 Disulfure de dimthyle (DMDS), (CH 3 S) 2 . 5.2.9 Acide actique, CH 3 COOH. 5.2.10 Actate dthyle, C 4 H 8 O. 5.2.11 Hexamthy
40、ldisilasane (HMDS). 5.2.12 Hexane, C 6 H 14 , pour lanalyse des rsidus. 5.2.13 Hydroxyde de potassium, KOH. 5.2.14 Mthanol, CH 3 OH, pour lanalyse des rsidus. 5.2.15 Sulfate de sodium, Na 2 SO 4 . 5.2.16 Thiosulfate de sodium, Na 2 S 2 O 3 , 5 H 2 O. 5.2.17 Colonne aminopropyle Chromabond 2) colonne
41、 NH 2 . 5.2.18 Pyridine, sche, 0,01 % deau au maximum. 1) Celite 545 est un exemple de produit appropri disponible sur le march. Cette information est donne lintention des utilisateurs du prsent document et ne signifie nullement que lISO approuve ou recommande lemploi exclusif du produit ainsi dsign
42、. 2) Chromabond est un exemple de produit appropri disponible sur le march. Cette information est donne lintention des utilisateurs du prsent document et ne signifie nullement que lISO approuve ou recommande lemploi exclusif du produit ainsi dsign. ISO/TS 29843-1:2010(F) 4 ISO 2010 Tous droits rserv
43、s5.2.19 Acide chlorhydrique, HCl. 5.2.20 Nitrate dargent, AgNO 3 . 5.2.21 Tolune, C 7 H 8 , scintillant. 5.2.22 Trimthylchlorosilane (TMSI). 5.2.23 Hydrognophosphate de potassium, K 2 HPO 4 . 5.2.24 Ester mthylique dacide nonadcanoque, C 20 H 40 O 2 . 5.2.25 Acide iodhydrique, HI, stabilis 57 % avec
44、 de lacide hydrophosphorique. 5.2.26 Isooctane, C 8 H 18 . 5.2.27 Iode, I 2 , 6 % dans de lther dithylique. 5.2.28 Carbonate de sodium, Na 2 CO 3 . 5.2.29 Poudre de zinc, de qualit GR pour analyses, granulomtrie de 45 m. 5.3 Tampons et talons 5.3.1 Tampon phosphate, 0,05 mol/l, 17,42 g de K 2 HPO 4d
45、ans 2 000 ml deau, en ajustant pH 7,4 avec du HCl 4 mol/l. 5.3.2 Solution mthanolique de KOH, 0,2 mol/l, 0,11 g de KOH dans 10 ml de mthanol. 5.3.3 Acide actique, 1 mol/l, 6,0 g dacide actique (100 %) dans 100 g deau. 5.3.4 Solution de carbonate de sodium, 0,1 mol/l, 5,3 g de Na 2 CO 3dans 500 ml de
46、au. 5.3.5 Solution de carbonate de sodium, 10 %, 40 g de Na 2 CO 3 , 5 H 2 O dans 360 g deau. 5.3.6 Solution de thiosulfate de sodium, 50 %, 272,5 g de Na 2 S 2 O 3 , 5 H 2 O dans 200 g deau. 5.3.7 talon interne (C19:0 FAME), solution mre contenant 25,0 mg dester mthylique dacide nonadcanoque dans 2
47、5,0 ml disooctane, puis dilution 1:10 avec de lisooctane 2,5 ml de solution mre (pipette de 5 ml) en compltant 25,0 ml avec de lisooctane; concentration finale de 32,05 nmol100 l 1 . 5.4 Appareillage Matriel courant de laboratoire et, en particulier, ce qui suit. 5.4.1 Colonne SCX, colonne changeuse de cations, de 0,5 g/3 ml, Bond Elut 1210-2040 3) . 5.4.2 Colonne SI, de 2 g/12 ml, Mega Bond Elut 1225-6018 4) . 3) Bond Elut 1210-2040 est un exemple de produit appropri disponible dans le commerce. Cette information est donne lintention des ut
