1、 Numro de rfrence ISO/TS 23893-2:2007(F) ISO 2007SPCIFICATION TECHNIQUE ISO/TS 23893-2 Premire dition 2007-11-15Qualit de leau Mesurages biochimiques et physiologiques sur poisson Partie 2: Dosage de lthoxyrsorufine-O-dthylase (EROD) Water quality Biochemical and physiological measurements on fish P
2、art 2: Determination of ethoxyresorufin-O-deethylase (EROD) ISO/TS 23893-2:2007(F) PDF Exonration de responsabilit Le prsent fichier PDF peut contenir des polices de caractres intgres. Conformment aux conditions de licence dAdobe, ce fichier peut tre imprim ou visualis, mais ne doit pas tre modifi m
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6、7 Droits de reproduction rservs. Sauf prescription diffrente, aucune partie de cette publication ne peut tre reproduite ni utilise sous quelque forme que ce soit et par aucun procd, lectronique ou mcanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans laccord crit de lISO ladresse ci-aprs ou du c
7、omit membre de lISO dans le pays du demandeur. ISO copyright office Case postale 56 CH-1211 Geneva 20 Tel. + 41 22 749 01 11 Fax. + 41 22 749 09 47 E-mail copyrightiso.org Web www.iso.org Publi en Suisse ii ISO 2007 Tous droits rservsISO/TS 23893-2:2007(F) ISO 2007 Tous droits rservs iii Sommaire Pa
8、ge Avant-propos. iv Introduction v 1 Domaine dapplication 1 2 Rfrences normatives 1 3 Principe 1 4 Environnement dessai. 1 5 Ractifs 2 6 Appareillage 3 7 chantillonnage et prparation des chantillons 4 7.1 chantillonnage des poissons 4 7.2 Mise mort des poissons et dissection. 4 7.3 Conservation . 4
9、8 Mode opratoire 5 8.1 Prparation des fractions 5 8.2 Dosage des protines. 5 8.3 Dosage de lactivit EROD. 5 8.4 Vrification de la sensibilit du ractif biologique et de la conformit du mode opratoire 7 9 Expression des rsultats . 7 9.1 Calcul de lactivit EROD . 7 9.2 Traitement statistique des donnes
10、 . 8 10 Rapport dessai . 8 Annexe A (informative) Exemples de rsultats . 9 Bibliographie 14 ISO/TS 23893-2:2007(F) iv ISO 2007 Tous droits rservsAvant-propos LISO (Organisation internationale de normalisation) est une fdration mondiale dorganismes nationaux de normalisation (comits membres de lISO).
11、 Llaboration des Normes internationales est en gnral confie aux comits techniques de lISO. Chaque comit membre intress par une tude a le droit de faire partie du comit technique cr cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec lISO participen
12、t galement aux travaux. LISO collabore troitement avec la Commission lectrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation lectrotechnique. Les Normes internationales sont rdiges conformment aux rgles donnes dans les Directives ISO/CEI, Partie 2. La tche principale des comits tech
13、niques est dlaborer les Normes internationales. Les projets de Normes internationales adopts par les comits techniques sont soumis aux comits membres pour vote. Leur publication comme Normes internationales requiert lapprobation de 75 % au moins des comits membres votants. Dans dautres circonstances
14、, en particulier lorsquil existe une demande urgente du march, un comit technique peut dcider de publier dautres types de documents normatifs: une Spcification publiquement disponible ISO (ISO/PAS) reprsente un accord entre les experts dans un groupe de travail ISO et est accepte pour publication si
15、 elle est approuve par plus de 50 % des membres votants du comit dont relve le groupe de travail; une Spcification technique ISO (ISO/TS) reprsente un accord entre les membres dun comit technique et est accepte pour publication si elle est approuve par 2/3 des membres votants du comit. Une ISO/PAS o
16、u ISO/TS fait lobjet dun examen aprs trois ans afin de dcider si elle est confirme pour trois nouvelles annes, rvise pour devenir une Norme internationale, ou annule. Lorsquune ISO/PAS ou ISO/TS a t confirme, elle fait lobjet dun nouvel examen aprs trois ans qui dcidera soit de sa transformation en
17、Norme internationale soit de son annulation. Lattention est appele sur le fait que certains des lments du prsent document peuvent faire lobjet de droits de proprit intellectuelle ou de droits analogues. LISO ne saurait tre tenue pour responsable de ne pas avoir identifi de tels droits de proprit et
18、averti de leur existence. LISO/TS 23893 a t labore par le comit technique ISO/TC 147, Qualit de leau, sous-comit SC 5, Mthodes biologiques. LISO 23893 comprend les parties suivantes, prsentes sous le titre gnral Qualit de leau Mesurages biochimiques et physiologiques sur poisson: Partie 1: chantillo
19、nnage des poissons, manipulation et conservation des chantillons Partie 2: Dosage de lthoxyrsorufine-O-dthylase (EROD) Spcification technique ISO/TS 23893-2:2007(F) ISO 2007 Tous droits rservs v Introduction Le mesurage des marqueurs biologiques de la pollution dans les poissons, tel que le mesurage
20、 des activits enzymatiques de biotransformation, fournit vraisemblablement des informations sur les niveaux dexposition, sur la biodisponibilit et sur les effets biologiques prcoces des substances prsentes dans les cosystmes aquatiques. Le mesurage de lactivit enzymatique de lEROD permet de raliser
21、un diagnostic de lexposition des poissons aux inducteurs du cytochrome P450 1A, tels que certains biphnyles polychlors (PCB), hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP), dioxines, etc. Une grande quantit de travaux de recherche tmoigne de limportance des tudes menes (voir Bibliographie). Linducti
22、on de lactivit EROD traduit la prsence dinducteurs tels que ceux mentionns ci-dessus. Dun autre ct, labsence dinduction ne dmontre pas ncessairement que les poissons nont pas t exposs des contaminants organiques, en considrant les phnomnes dinhibition de linduction de lEROD dune modification possibl
23、e de la biodisponibilit des inducteurs ou lexposition de faibles concentrations. Lapplication dune mthode de rfrence normalise est fortement conseille dans un programme de surveillance. Les exercices dintertalonnage sur le mesurage de lactivit enzymatique de lEROD entrepris depuis 1991 ont rvl de no
24、mbreuses sources derreurs trs faciles viter (dilution de la rsorufine, dosage des protines, calcul de lactivit enzymatique, etc.) une fois que les laboratoires se sont familiariss avec lanalyse des activits enzymatiques et les facteurs derreur possibles. SPCIFICATION TECHNIQUE ISO/TS 23893-2:2007(F)
25、 ISO 2007 Tous droits rservs 1 Qualit de leau Mesurages biochimiques et physiologiques sur poisson Partie 2: Dosage de lthoxyrsorufine-O-dthylase (EROD) 1 Domaine dapplication La prsente partie de lISO 23893 spcifie une mthode pour mesurer lactivit enzymatique de lthoxyrsorufine-O-dthylase (EROD) su
26、r une fraction post-mitochondriale du broyat du foie de poisson (fraction subcellulaire dans laquelle lactivit EROD est localise) en employant une mthode danalyse fluorimtrique avec une cuve ou des microplaques. Elle sapplique aux poissons prlevs dans leur environnement naturel (eau douce ou eau sal
27、e) ou aux poissons exposs des substances ou effluents dans un laboratoire. Cette mthode est applicable pour les valeurs de lEROD suprieures ou gales 1 pmol/(minmg) de protines. Une sensibilit plus leve peut tre obtenue en utilisant un mode opratoire employant une cuve (tube essai). 2 Rfrences normat
28、ives Les documents de rfrence suivants sont indispensables pour lapplication du prsent document. Pour les rfrences dates, seule ldition cite sapplique. Pour les rfrences non dates, la dernire dition du document de rfrence sapplique (y compris les ventuels amendements). ISO 23893-1, Qualit de leau Me
29、surages biochimiques et physiologiques sur poisson Partie 1: chantillonnage des poissons, manipulation et conservation des chantillons 3 Principe Les chantillons de poissons sont prlevs et dissqus tel que dcrit dans lISO 23893-1 pour obtenir des morceaux de foie. Des broyats de foie de poisson sont
30、prpars (homognisation) et le surnageant (fraction S9) est rcupr par centrifugation. Lactivit enzymatique de lEROD dans les fractions S9 est dose en mesurant laugmentation de la fluorescence due la transformation de la 7-thoxyrsorufine en rsorufine. La fluorescence est rapporte en quantits de rsorufi
31、ne laide dune gamme talon (talonnage externe de rsorufine ou de rhodamine B). Lactivit EROD est relie la quantit de protines de la fraction S9. 4 Environnement dessai Tous les essais et les oprations de manipulation avec la fraction S9 doivent tre raliss une temprature proche de 4 C (par exemple man
32、ipulation dans de la glace pile), lexception de la raction enzymatique, qui doit tre ralise 20 C 2 C. ISO/TS 23893-2:2007(F) 2 ISO 2007 Tous droits rservs5 Ractifs Sauf indications contraires, utiliser uniquement des ractifs de qualit analytique reconnue. 5.1 Eau ultra pure, de conductivit infrieure
33、 1 S/cm. 5.2 Chlorure de potassium, solution de 150 mmol/l. Dissoudre 11,2 g de KCl (masse molculaire relative de 74,6) dans 1 l deau (5.1). Cette solution est stable durant six mois une temprature de 4 C 3 C. 5.3 Tampon phosphate, 100 mmol/l; pH 7,8 0,1. La composition ionique et le pH peuvent affe
34、cter lactivit EROD et les conditions optimales peuvent varier selon les espces. Le tampon suivant doit fournir des valeurs mesurables et comparables de lactivit EROD pour la plupart des espces de poissons. Prparer les deux solutions suivantes, A et B: Solution A: dissoudre 17,4 g de K 2 HPO 4(masse
35、molculaire relative de 174,2) dans 1 l deau (5.1); Solution B: dissoudre 13,6 g de KH 2 PO 4(masse molculaire relative de 136,1) dans 1 l deau (5.1). Ajuster le pH de la solution A 7,8 0,1 avec la solution B. Cette solution est stable durant six mois une temprature de 4 C 3 C. 5.4 Glycrol (20 %) dan
36、s la solution tampon phosphate. Ajouter une fraction massique de 20 % de glycrol (C 3 H 8 O 3 ; masse molculaire relative de 92,1) au tampon phosphate (5.3). Les concentrations finales sont ensuite de 20 % de glycrol et 100 mmol/l de phosphate. 5.5 Solution mre de rsorufine (108 mg/l). Dissoudre 10,
37、8 mg de rsorufine (sel de sodium C 12 H 6 NNaO 3 ; masse molculaire relative de 235,17) dans 100 ml de dimthylsulfoxyde (DMSO) labri de la lumire et en agitant durant 2 h. Lire la densit optique 572 nm sur le spectrophotomtre. Calculer la concentration exacte de rsorufine, c, en millimoles par litre
38、, en utilisant lquation (1): D c l = (1) o D est la densit optique (correspondant au nombre donde de labsorbance, en cm 1 ); est le coefficient dextinction molaire pour la rsorufine, des valeurs de = 73,2 (mmol/l) 1 cm 1 572 nm (voir Rfrence 17 ) et 54,0 1,1 mmol cm 1(voir Rfrence 36) ont t consigne
39、s; l est la longueur du chemin optique, en centimtres. Prparer cette solution au moment du dosage et conserver des aliquotes de cette solution congeles 20 C labri de la lumire. Ces aliquotes peuvent tre conserves durant six mois. NOTE La rsorufine est trs instable lorsquelle est expose la lumire du
40、jour. ISO/TS 23893-2:2007(F) ISO 2007 Tous droits rservs 3 5.6 Solution prpare de rsorufine. Diluer la solution mre (5.5) avec du dimthylsulfoxyde (DMSO) de manire obtenir environ 10 ml de la solution prpare 11,5 mol/l. Prparer cette solution au moment du dosage. 5.7 Solution tmoin de rhodamine B. D
41、issoudre 25 mg de rhodamine B (C 28 H 30 N 2 O 3 ; masse molculaire relative de 442,55) dans 250 ml dthylne glycol monomthyl ther. Diluer cette solution avec de lthylne glycol monomthyl ther de manire obtenir une solution talon de 0,1 mol/l conserver sous forme daliquotes. Cette solution demeure sta
42、ble durant six mois labri de la lumire et une temprature de 4 C 3 C. 5.8 Nicotinamide adnine dinuclotide phosphate (NADPH). Pour la mthode avec microplaque, dissoudre 19,2 mg de -NADPH (C 21 H 26 N 7 Na 4 O 17 P 3 ; masse molculaire relative de 833,35) dans 2 ml deau (5.1) pour obtenir 10 mmol/l. Pr
43、parer cette solution au moment du dosage et la maintenir labri de la lumire dans de la glace. NOTE Pour la mthode employant une cuve (tube essai), 41,7 mg de NADPH sont dissous dans 1 ml deau (5.1) pour obtenir 50 mmol/l. 5.9 Solution mre de 7-thoxyrsorufine. Prparer une solution mre de 7-thoxyrsoru
44、fine concentre (C 12 H 6 NaO 3 ; masse molculaire relative de 235,17), par exemple 5 mg/ml, dans du dimthylsulfoxyde (DMSO). Conserver cette solution labri de la lumire temprature ambiante durant un an au maximum. 5.10 Solution prpare de 7-thoxyrsorufine (46 mol/l). Mesurer la concentration exacte d
45、e la solution mre (5.9) avec un spectrophotomtre 482 nm en utilisant lquation (1). 482 nm, le coefficient dextinction molaire est de 2,25 10 4(mol/l) 1 cm 1 . Diluer la solution mre (5.9) avec du DMSO afin dobtenir une solution prpare de 46 mol/l pour la mthode avec microplaque. Prparer cette soluti
46、on au moment du dosage. NOTE Une solution prpare de 400 mol/l est utilise pour la mthode employant une cuve (tube essai). 5.11 -naphthoflavone dissoute dans lhuile darachide. Pour linjection dune dose de 50 mg de -naphthoflavone (C 19 H 12 O 2 ; masse molculaire relative de 272,3) par kilogramme de
47、poisson (injection de 10 l de solution dans lhuile par gramme de poisson), prparer une solution de 5 mg de -naphtoflavone par millilitre dhuile darachide. Cette solution est agite et amene une temprature de 45 C 5 C en utilisant un bain deau afin damliorer lhomognit. NOTE Une dose mme 10 fois infrieure 50 mg/kg de poisson peut savrer suffisante pour linduction de lEROD. Par consquent, il nest pas trs i
