1、NORME I NTER NATIONALE IS0 91 67-1 Premire 6dition 1992-07-0 1 Graines de colza - Dosage des glucosinolates - Partie 1: Mthode par chromatographie liquide haute performance Rapeseed - Determination of glucosinolates content - Part I: Method using high-performance liquid chromatography _ _- Numro de
2、rfrence _. IS0 9167-1.1992(F) IS0 9167-1:1992(F) Avant-propos LISO (Organisation internationale de normalisation) est une fdration mondiale dorganismes nationaux de normalisation (comits membres de IISO). Llaboration des Normes internationales est en gnral confie aux comites techniques de llS0. Chaq
3、ue comit membre int- ress par une tude a le droit de faire partie du comit technique cr cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec IISO participent galement aux tra- vaux. LISO collabore troitement avec la Commission lectrotechnique intern
4、ationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation lectrotech- nique. Les projets de Normes internationales adopts par les comits techni- ques sont soumis aux comits membres pour vote. Leur publication comme Normes internationales requiert lapprobation de 75 au moins des comitCts membres votants. La
5、 Norme internationale IS0 9167-1 a t labore par le comit tech- nique ISO/TC 34, Produits agricoles alimentaires, sous-comit SC 2, Graines et fruits olagineux. LISO 9167 comprend les parties suivantes, prsentes sous le titre ge- neral Graines de colza - Dosage des glucosinolates: - Partie 1; Mthode p
6、ar chromatographie liquide haute perfor- niance - Partie 2; - Mthode par spectromtrie de fluorescence aux rayons X Lannexe A de la prsente partie de IISO 9167 est donne uniquement tit re d inform at ion . 0 IS0 1992 Droits de reproduction reserves. Aucune partie de cette publication ne peut tre repr
7、o- duite ni utilise sous quelque forme que ce soit et par aucun procede, electronique ou mcanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans laccord ecrit de iediteur. Organisation internationale de normalisation Case Postale 56 CH-1211 Genve 20 Suisse imprim en Suisse ii NORME INTERNATIONALE
8、IS0 9167-1:1992(F) Graines de colza - Dosage des glucosinolates - Partie 1: Mthode par chromatographie liquide haute performance 1 Domaine dapplication La prsente partie de IISO 9167 prescrit une m- thode de dosage par chromatographie liquide haute performance (CLHP) des diffrents glucosinolates dan
9、s les graines de colza. NOTES 1 Cette mthode ne dose pas les glucosinolates ayant des substituants sur la partie glucose, mais ces compos6s sont peu importants dans les graines de colza commer- cialises. 2 Une mthode rapide de dosage global des glucosinolates des graines de colza, par spectromtrie d
10、e fluorescence aux rayons X (XRF) fait lobjet de IISO 9167-2. 2 Rfrences normatives Les normes suivantes contiennent des dispositions qui, par suite de la rfrence qui en est faite, constituent des dispositions valables pour la pr- sente partie de IISO 9167. Au moment de la publi- cation, les ditions
11、 indiques taient en vigueur. Toute norme est sujette rvision et les parties prenantes des accords fonds sur la prsente partie de IISO 9167 sont invites rechercher la possi- bilit dappliquer les ditions les plus rcentes des normes indiques ci-aprs. Les membres de la CE1 et de IISO possdent le registr
12、e des Normes inter- nationales en vigueur un moment donn. IS0 664:1990, Graines olagineuses .- Rduction de lchantillon pour laboratoire en chantillon pour essai. IS0 665: 1977, Graines olagineuses - Dtermination de la teneur en eau et matires volatiles. IS0 3696:1987, Eau pour laboratoire usage anal
13、yti- que - Spcification et mthodes dessai. 3 Principe Extraction des glucosinolates par le mthanol, puis purification et dsulfatation enzymatique sur rsines ch a n g e u s e s d ions. D termination par chroma to- graphie liquide haute performance en phases in- verses avec gradient dlution et dtectio
14、n aux ultraviolets. 4 Ractifs Sauf spcification contraire, utiliser uniquement des ractifs de qualit analytique reconnue et de leau de grade 2, conformment IISO 3696. 4.1 Mthanol, qualit CLHP, solution 70 O/O (V/V). 4.2 Actate de sodium, solution 0,02 mol/l de pH 4,O. 4.3 Actate de sodium, solution
15、a 0,2 mol/l 4.4 Formate dimidazole, solution 6 mol/l. Dissoudre 204 g dimidazole dans 113 ml dacide formique dans une fiole jauge de 500 ml. Ajuster au trait repre avec de leau. 4.5 talon interne, utiliser soit la sinigrine monohydrate (allylglucosinolate, sel de potassium monohydrate, M, = 415,49)
16、(voir 4.5.1) soit, pour le colza (cultiv ou adventice) dans lequel la sinigrine est prsente nature I le ment, I a glucotropaoline (be nzylg I ucos i no1 a te, sel de pot as si um , M, = 447,52) (voir 4.5.2). 1 IS0 91 67-1 :1992(F) Pour le colza A faible teneur en glucosinolates ( 20 prn/g), rduire l
17、a concentration de ltalon interne (1 mmol/l 3 mmol/l) en 4.5.1 et 4.5.2.1 , 4.5.1 Sin igri n e mono h yd rate 4.5.1.1 Sinigrine monohydrate, solution 5 mmol/l. Dissoudre 207,7 mg dallylglucosinolate de potas- sium monohydrat dans de leau, dans une fiole jauge de 100 ml. Ajuster au trait repre avec d
18、e leau. La solution ainsi prpare peut tre conserve au rfrigrateur Q 4 “C pour une conservation dune semaine ou au conglateur (- 18 “C) pour une conservation plus longue. 4.5.1.2 Sinigrine monohydrate, solution 20 mrnol/l. Dissoudre 831,O mg dallylglucosinolate de potas- sium monohydrat dans de leau,
19、 dans une fiole jauge de 100 ml. Ajuster au trait repre avec de leau. La solution ainsi prpare peut tre conserve au rfrigrateur 4 “C environ pour une conservation dune semaine ou au conglateur (- 18 OC) pour une conservation plus longue. 4.5.1.3 ContrGle de puret Utiliser un ou plusieurs des trois t
20、ests suivants: - lanalyse par CLHP ralise par la mthode prescrite dans la prsente partie de IISO 9167; - lanalyse de la sinigrine intacte par CLHP (tech- nique par appariement dions); - lanalyse par chromatographie en phase ga- Dans ces tests, le pic majeur doit reprsenter au moins 98 Confirmer la p
21、uret par une dtermination de la quantit de glucose libr aprs hydrolyse avec la myrosinase (thioglucoside glucohydrolase EC 3.2.3.1). Mesurer le glucose par voie enzymatique. Lutilisation dun coffret du commerce facilite la d- termination. Tenir compte du glucose libre ven- tuellement prsent qui sera
22、 mesur sans addition de myrosinase. La concentration molaire de glucose zeuse de la sinigrine dsulfate et silyle. de la surface totale des pics. mesure devrait tre gale au moins 98 O/O de la concentration molaire de la solution de sinigrine teste. 4.5.2 Glucotropaeoline NOTE 3 sparer dautres glucosi
23、nolates naturels mineurs. La glucotropaoline est quelquefois difficile 4.5.2.1 Glucotropaoline, solution 5 mmol/l. Dis- soudre 233,8 mg de glucotropaoline dans de leau, dans une fiole jauge de 100 ml. Ajuster au trait re- pere avec de leau. 4.5.2.2 Glucotropaoline, solution 20 mmol/l. Dis- soudre 89
24、5,O mg de glucotropaoline dans de leau, dans une fiole jauge de 100 ml. Ajuster au trait re- pre avec de leau. 4.5.2.3 Contrle de puret Contrler la puret conformment au mode op- ratoire indiqu en 4.5.1.3. 4.5.2.4 Coefficients de rponse Vrifier que les coefficients de rponse de la glucotropaoline, co
25、mpars la sinigrine, corres- pondent ceux indiqus en 9.2. 4.6 Phases mobiles 4.6.1 Eluant A: eau, purifie par passage sur car- touche de charbon actif (par exemple systme Norganic MiIlipore” ou eau de qualit quivalente. 4.6.2 Eluant B: actonitrile, qualit CLHP, solution 20 O/O (Vir3 dans leau purifie
26、. La concentration peut tre modifie en fonction de la colonne utilisCe. 4.7 Resine changeuse dions, utiliser 4 7.1 ou 472 4.7.1 lemploi ou produit quivalent. Suspension DEAE Sepharose CL-6B7), prte a 4.7.2 Suspension DEAE Sephadex A251), prpare comme suit. Mlanger log de rsine DEAE Sephadex A25 (ou
27、dune rsine b) verser 1 ml dthylne diamine dans une fiole jauge de 500 ml et ajuster au trait repre avec de leau; c) mlanger 73 ml de solution a) et 40 ml de solu- tion b) et ajuster pH 5,8 avec les solutions a) ou b). Verser 3 ml de la solution de sinigrine 5 mmol/l (4.5.1) dans une fiole jauge de I
28、00 ml et ajuster au trait repre avec la solution c). 4.8.3.2 Contrle de lactivit Verser, la pipette, 2 ml de la solution de sinigrine tamponne (4.8.3.1) dans les cuves de rfrence et de mesure du spectromtre (5.3) rgl une lon- gueur donde de 229 nm avec une temprature des cuves de 30 “C. Au temps t =
29、 O, verser dans la cuve de mesure 50 pl de la sulfatase purifie (4.8.2) et mettre en marche lenregistreur. Arrter Ienregis- treur quand Iabsorbance ne varie plus (A,), tracer la tangente au point t =O et mesurer sa pente AAIAi. Lactivitk de la sulfatase (cest-dire la production de 1 micromole de sin
30、igrine dsulfate par minute 30 “C et pH 5,8), exprime en units dactivit par millilitre de solution de sulfatase, est gale AA V 1000 106 At AC 50 -x-x- o AA/At est la pente de la tangente au point (=O, en units dabsorbance par mi- nute: V est le volume, en litres, du milieu ractionnel (soit 2,05 x I);
31、 Ar: est la diffrency (de lordre de 1 500 I,mol- ,cm- ) des coefficients dextinction molaire de la sinigrine et de la dsulfosinigrine 228 nm, cest- -dire A, AC =- ic OU A, est la diffrence entre Iabsor- bance Iquilibre de la sinigrine dsulfate et Iabsor- bance au temps 1 = O; I est le parcours optiq
32、ue de la cuve, en centimtres (soit 1 cm); c est la concentration de la sinigrine dsulfate Iquili- bre, en moles par litre, soit 3) MiIlipore PTGC llK25 est un exemple de produit appropri disponible sur IF! march. Cette information est donne lintention des utilisateurs de la prsente partie de IISO 91
33、67 et ne signifie nullement que llS0 approuve ou recommande lemploi exclusif du produit ainsi dsign. 3 IS0 9167-1:1992(F) 0,15 x x 0,95 x 2 2,05 c= = 1,39 x 10 mol/l 0,95 correspond au rendement Iquilibre de la dsulfatation de la sinigrine. On peut galement calculer lactivit de la sulfatase laide de
34、 la formule simplifie suivante: AA x 5,7 AtA, 4.8.4 Dilution Verser, la pipette, 1 ml de sulfatase purifie (4.8.2) dans une fiole jauge de 10 ml, ajuster au trait repere avec de leau et mlanger. Cette solution est divise en petites quantits et stocke au conglateur - 18 “C. 5 Appareillage Matriel cou
35、rant de laboratoire, et notamment: 5.1 Chromatographe liquide a haute performance, permettant dobtenir un gradient dlution et un contrle de la temprature de la colonne 30 “C, reli un dtecteur ultraviolet permettant les rne- sures une longueur donde de 229 nm. 5.2 Colonne de chromatographie pour CLHP
36、, de type CI8, ou C8 de granulomtrie infrieure ou gale 5 pm, soit par exemple4) Colonne Lichrosorb RP18, G 5 pm (150 mm x 4.6 mm) Colonne Spherisorb ODS2, 5 pm (250 rnm x 4 mm; 250 mm x 5 mm) Colonne Novapak C18, 4 pm (150 mm x 4 mm) Colonne Lichrospher RP8, 5 irm (125 nirn x 4 mm) Colonne Nuclosil
37、C18, g 5 pm (200 mm x 4 mm) Les performances de la colonne choisie doivent tre rgulirement contrles laide, de prfrence, dun chantillon de rfrence de colza dsulfoglucosinolates. En particulier, la colonne ne doit pas dgrader Ihydroxy-4 glucobrassicine, un glucosinolate important, mais relativement in
38、stable. Les nouvelles colonnes doivent faire lobjet dune mise en condition prliminaire, selon les instruc- tions du fabricant, avant de pouvoir obtenir des r- sultats reproductibles. 5.3 Spectrometre a double faisceau, permettant doprer dans lultraviolet et temprature contr- le de 30 “C, muni de cuv
39、es en quartz de 1 cm de parcours optique et dun systme enregistreur. 5.4 Microbroyeur, par exempte moulin caf. 5.5 Centrifugeuse, convenant pour lutilisation avec les tubes (5.6), permettant dobtenir une accl- ration centrifuge de 5 OOOg. 5.6 Tubes en polypropylene, de 6 ml de capacit 5.7 Bain deau
40、ou bloc de chauffage, reglable 75 “C. 5.8 Laine de verre. 5.9 appropri, ou tout autre dispositif adquat. Pipettes Pasteur, de 150 mm de long, et support 6 chantillonnage Il convient que Ichantillonnage ait t effectu conformment IISO 542. Si, avant la rduction de Ichantillon pour labora- toire, on a
41、spar les gros corps trangers non olagineux, il en sera tenu compte dans les calculs. 4) Les exemples donns sont des produits appropris disponibles sur le march Cette information est donne 8 lintention des utilisateurs de la prsente partie de IISO 9167 et ne signifie nullement que IISO approuve ou recommande lemploi exclusif des produits ainsi dsigns. 5) Des chantillons de rfrence de dsulfoglucosinolate de colza peuvent tre obtenus auprs du Bureau Communautaire de Rfrence. 4
