1、NORME INTERNATIONALE Premire dition 1997-08-01 Aliments des animaux - Dtermination de la teneur en azote soluble aprs traitement avec de la pepsine dans lacide chlorhydrique dilu Animal feeding stuffs - Determination of soluble nitrogen content after treatment with pepsin in dilute hydrochloric acid
2、 Num a=400net; p=iso; o=isocs; s=central Imprime en Suisse NORME INTERNATIONALE o Iso ISO 6655: 1997(F) Aliments des animaux - Dtermination de la teneur en azote soluble aprs traitement avec de la pepsine dans lacide chlorhydrique dilu 1 Domaine dapplication La prsente Norme internationale prescrit
3、une mthode pour la dtermination dans les aliments des animaux, de la teneur en azote soluble aprs traitement avec de la pepsine dans lacide chlorhydrique dilu. Cette mthode ne permet pas de diffrencier lazote protique de lazote non protique. NOTE 1 Les valeurs obtenues en utilisant la prsente mthode
4、 nont pas de rapport direct avec la digestibilit in vivo. NOTE 2 En cas dexclusion de lazote non protique dans le rsultat de lessai, il convient de dterminer sa teneur en utilisant une mthode approprie. 2 Rfrences normatives Les normes suivantes contiennent des dispositions qui, par suite de la rfre
5、nce qui en est faite, constituent des dispositions valables pour la prsente Norme internationale. Au moment de la publication, les ditions indiques taient en vigueur. Toute norme est sujette rvision et les parties prenantes des accords fonds sur la prsente Norme internationale sont invites recherche
6、r la possibilit dappliquer les ditions les plus rcentes des normes indiques ci-aprs. Les membres de la CEI et de IISO possdent le registre des Normes internationales en vigueur un moment donn. ISO 5983: 1997), Aliments des animaux - Dtermination de la teneur en azote et calcul de la teneur en protin
7、es brutes - Mthode Kjeldahl. I SO 6498:-2, Aliments des animaux - Prparation des chantillons pour essai. 3 Principe Incubation de lchantillon pendant 48 h 40 OC dans une solution de pepsine dans lacide chlorhydrique dilu. Filtration de la suspension et dtermination de la teneur en azote, soit sur le
8、 filtrat, soit sur le rsidu contenu dans le filtre, conformment la mthode Kjeldahl prescrite dans IISO 5983. Dans ce dernier cas, dtermination galement de la teneur en azote de lchantillon conformment IISO 5983. ) publier. (Rvision de IISO 5983:1979) 2, publier. (Rvision de IISO 6498:1983) 1 ISO 665
9、5: 1997(F) 0 ISO 4 Ractifs Utiliser uniquement des ractifs de qualit analytique reconnue et de leau distille ou dminralise ou de leau de puret au moins quivalente. Tous les ractifs ( lexception des ractifs talons) doivent tre pratiquement exempts de composs azots. 4.4 Acide chlorhydrique dilu, C(HI)
10、 = 0,075 mol/l. 4.2 Pepsine, ayant une activit de 2,0 units par milligramme conformment la dfinition donne en annexe A. Contrler lactivit de la pepsine conformment la mthode prescrite en annexe A. 4.3 Solution de pepsine dans lacide chlorhydrique, ayant une activit de pepsine denviron 400 units par
11、litre. IDissoudre 0,2 g + 0,001 g de pepsine (4.2) dans 1 litre dacide chlorhydrique dilu (4.1). Prparer cette solution extemporanment. Si lactivit de la pepsine dvie de 2,0 units par milligramme, ajuster la masse de pepsine pour obtenir une solution ayant une activit de pepsine de 400 units par lit
12、re. 4.4 Acide chlorhydrique, C(HI) = 75 mol/1 (20 = 1,125 g/ml). 5 Appareillage Matriel courant de laboratoire et, en particulier, ce qui suit. 5.1 Bain deau ou tuve, rglable 40 OC + 1 OC. 5.2 Ballons minralisation de Kjeldahl, de capacit approprie. 5.3 Papier filtre, filtration rapide, rsistant aux
13、 acides. 5.4 Matriel de distillation et de titrage. 6 chantillonnage Lchantillonnage ne fait pas partie de la mthode prescrite dans la prsente Norme internationale. Une mthode dchantillonnage recommande est donne dans IISO 6497 L31. II est important que le laboratoire reoive un chantillon rellement
14、reprsentatif, non endommag ou modifi lors du transport et de lentreposage. 7 Prparation de lchantillon pour essai Prparer lchantillon pour essai conformment IISO 6498. Si la teneur en matires grasses de lchantillon pour essai dpasse 10 % (mlm), extraire les conformment IBSO 6498 et tenir compte de l
15、a teneur en huile extraite lors du calcul (article 9) . matires grasses 2 0 ISO ISO 6655:1997(F) 8 Mode opratoire 8.1 Prise dessai Peser, 0,001 g prs, environ 2 g de lchantillon prpar pour essai. 8.2 Incubation Introduire la prise dessai dans une fiole jauge de 500 ml et ajouter 450 ml de solution d
16、e pepsine (4.3) pralablement chauffe 40 OC. Agiter de faon viter la formation dagglomrats. Vrifier que le pH de la suspension est infrieur 1,7. Placer la fiole dans le bain deau ou dans ltuve (5.1) rgl(e) 40 OC et ly maintenir pendant 48 h. Agiter aprs 8 h, 24 h et 32 h. Au bout de 48 h, ajouter 15
17、ml dacide chlorhydrique (4.4) et refroidir jusqu 20 OC. Complter au trait repre avec de leau, agiter et filtrer sur papier filtre (5.3) puis procder conformment 8.3 ou 8.4. 8.3 Dtermination de la teneur en azote du filtrat 8.3.1 Minralisation de la matire organique Prlever 250 ml du filtrat (8.2) et
18、 les introduire dans un ballon minralisation de Kjeldahl (5.2). Ajouter les ractifs ncessaires pour la minralisation comme prescrit au paragraphe 8.2.1 de IISO 5983:1997. Mlanger et chauffer bullition. NOTE - II peut tre utile dajouter un antimousse. Maintenir la solution vive bullition jusqu vapora
19、tion presque complte de leau. liminer les dernires traces deau avec prcaution, en rduisant lintensit du chauffage. Lorsque la solution devient limpide, poursuivre lbullition pendant 1 h encore, puis laisser refroidir. 8.3.2 Distillation et titrage Procder comme prescrit aux paragraphes 8.2.2 et 8.2.
20、3 de IISO 5983:1997. 8.3.3 Essai blanc Raliser un essai blanc en utilisant le mme mode opratoire mais en omettant la prise dessai. Procder comme prescrit larticle 9. 8.4 Dtermination de la teneur en azote du rsidu et de lchantillon pour essai 8.4.1 Minralisation de la matire organique dans le rsidu
21、Laver le papier filtre et le rsidu (8.2) avec de leau chaude jusqu limination de lacidit. Transfrer le filtre avec le rsidu dans un ballon minralisation de Kjeldahl (5.2). Ajouter les ractifs ncessaires pour la minralisation comme prescrit au paragraphe 8.2.1 de IISO 5983:1997. Mlanger et chauffer b
22、ullition. NOTE - II peut tre utile dajouter un antimousse. liminer leau en portant la solution vive bullition tout dabord, puis en rduisant lintensit du chauffage pour liminer les dernires traces deau. Lorsque la solution devient limpide, poursuivre lbullition pendant 1 h encore, puis laisser refroi
23、dir. 8.4.2 Distillation et titrage Procder comme prescrit aux paragraphes 8.2.2 et 8.2.3 de IISO 5983:1997. 8.4.3 Dtermination de la teneur en azote de lchantillon pour essai Dterminer la teneur en azote de lchantillon pour essai prpar (voir larticle 7) conformment IISO 5983. 8.4.4 Essai blanc Effec
24、tuer un essai blanc en utilisant le mme mode opratoire, mais en omettant la prise dessai. ISO 6655: 1997(F) 0 ISO 9 Expression des rsultats 9.1 Calcul de la teneur en azote soluble obtenu en utilisant le mode opratoire prescrit en 8.3 Si les quantits dacide sulfurique utilises pour rcuprer lammoniac
25、 lors de la dtermination et lors de lessai blanc sont gales (voir IISO 5983) calculer la teneur en azote soluble de lchantillon pour essai laide de lquation suivante: Wl = 2 (vo -V,)XcXM m w1 est la teneur en azote soluble, en grammes par kilogramme, de lchantillon pour essai, obtenu selon le mode o
26、pratoire prescrit en 8.3; C est la concentration, en moles par litre, de la solution dhydroxyde de sodium (voir le paragraphe 4.9.1 de IISO 5983:1997), utilise pour les titrages; m est la masse, en grammes, de la prise dessai; M est la masse molaire, en grammes par mole, de lazote (M = 14 g/mol); Vo
27、 est le volume, en millilitres, de la solution dhydroxyde de sodium (voir le paragraphe 4.9.1 de IISO 5983:1997), utilis pour lessai blanc; VI est le volume, en millilitres, de la solution dhydroxyde de sodium (voir le paragraphe 4.9.1 de IISO 5983:1997), utilis pour la dtermination (8.3.2). Noter l
28、e rsultat 0,l g/kg prs. 9.2 Calcul de la teneur en azote soluble obtenu en utilisant le mode opratoire prescrit en 8.4 Si les quantits dacide sulfurique utilises pour rcuprer lammoniac lors de la dtermination et lors de lessai blanc sont gales (voir IISO 5983), calculer la teneur en azote soluble de
29、 lchantillon pour essai laide de lquation suivante: =WN (V,-Vl)xcxM W2 - m o w2 est la teneur en azote soluble, en grammes par kilogramme, de lchantillon pour essai, obtenu selon le mode opratoire prescrit en 8.4; C est la concentration, en moles par litre, de la solution dhydroxyde de sodium (voir
30、le paragraphe 4.9.1 de IISO 5983:1997), utilise pour les titrages; m est la masse, en grammes, de la prise dessai; M est la masse molaire, en grammes par mole, de lazote (M = 14 g/mol); Vo est le volume, en millilitres, de la solution dhydroxyde de sodium (voir le paragraphe 4.9.1 de IISO 5983:1997)
31、, utilis pour lessai blanc; V, est le volume, en millilitres, de la solution dhydroxyde de sodium (voir le paragraphe 4.9.1 de IISO 5983:1997), utilis pour la dtermination (8.4.2); wN est la teneur en azote total, en grammes par kilogramme, de lchantillon pour essai, dtermine en 8.4.3. Noter le rsul
32、tat 0,l g/kg prs. 4 0 ISO ISO 6655: 1997(F) 9.3 Calcul de la teneur en protines brutes solubles Si lon dsire exprimer le rsultat en protines brutes solubles, multiplier la teneur en azote dtermine par le facteur 6,25. 10 Fidlit 10.1 Essai interlaboratoire Les dtails dun essai interlaboratoire relati
33、f la prcision de la mthode sont donns en annexe B. Les valeurs provenant de lessai interlaboratoire ne peuvent tre appliques aux plages de concentrations et aux matrices autres que celles donnes. 10.2 Rptabilit La diffrence absolue entre deux rsultats dessai individuels indpendants, obtenus laide de
34、 la mme mthode sur un matriau identique soumis lessai dans le mme laboratoire par le mme oprateur utilisant le mme appareillage et dans un court intervalle de temps, ne sera pas suprieure la valeur r figurant dans le tableau 1 dans plus de 5 % des cas. 10.3 Reproductibilit La diffrence absolue entre
35、 deux rsultats dessai individuels, obtenus laide de la mme mthode sur un matriau identique soumis lessai dans des laboratoires diffrents par des oprateurs diffrents utilisant des appareillages diffrents, ne sera pas suprieure la valeur R figurant dans le tableau 1 dans plus de 5 % des cas. Tableau 1
36、 - Limites de rptabilit (r) et de reproductibilit (28) Teneur moyenne en protines R chantillon brutes solubles r g/kg 1 ml mg Farine de luzerne 136,6 72 26,5 Gluten de mas 1415 89 9 28,9 Farine de coprah 149,5 794 31,6 Ensilage dherbe 192,9 79 9 36,3 Farine dos 512,0 89 II 63,l Farine de plume 574,3
37、 22,l 166,3 1) Sur matire sche. 11 Rapport dessai Le rapport dessai doit indiquer - tous les renseignements ncessaires lidentification complte de lchantillon; - ta mthode selon laquelle lchantillonnage a t effectue, si elle est connue; - ta mthode utilise; PS0 6655: 1997(F) OIS0 - le (les) rsultat(s
38、) dessai obtenu(s), exprim(s) en azote soluble ou en protines brutes solubles et, dans ce cas, le facteur de conversion utilis (cest-dire 6,25); - si la rptabilit a t vrifie, le rsultat final cit qui a t obtenu; - tous les dtails opratoires non prvus dans la prsente Norme internationale, ou facultat
39、ifs, ainsi que les incidents ventuels susceptibles davoir agi sur le (les) rsultat(s) dessai. 0 ISO Annexe A (normative) Dtermination de lactivit de la pepsine ISO 6655:1997(F) A.1 Domaine dapplication La prsente annexe prescrit une mthode pour la dtermination de lactivit de la pepsine utilise dans
40、la dtermination de la teneur en azote soluble aprs traitement avec de la pepsine dans lacide chlorhydrique dilu. A.2 Dfinition Pour les besoins de la prsente annexe, la dfinition suivante sapplique. A.2.1 unit dactivit de pepsine Quantit de pepsine qui libre par minute, dans les conditions prescrite
41、s, une quantit de groupements hydroxyaryle dont la coloration par le ractif de Folin-Ciocalteu a une absorbante correspondant celle de 1 umol de tyrosine dans les mmes conditions. A.3 Principe Traitement de lhmoglobine avec de la pepsine dans lacide chlorhydrique dilu. Prcipitation de la fraction no
42、n hydrolyse des protines par lacide trichloroactique. Filtration et addition dhydroxyde de sodium et de ractif de Folin-Ciocalteu. Mesurage de Iabsorbance de cette solution la longueur donde de 750 nm et dtermination de la quantit correspondante de tyrosine partir dune courbe dtalonnage. A.4 Ractifs
43、 Utiliser uniquement des ractifs de qualit analytique reconnue et de leau distille ou dminralise ou de leau puret au moins quivalente. A.4.1 Acide chlorhydrique, C(HI) = 0,2 mol/l. A.4.2 Acide chlorhydrique, C(HI) = 0,06 mol/l. A.4.3 Acide chlorhydrique, C(HI) = 0,025 mol/l. A.4.4 Acide trichloroact
44、ique, solution, p(CCI3CO2H) = 50 g/l. A.4.5 Hydroxyde de sodium, solution, c(NaOH) = 0,025 mol/l. A.4.6 Ractif de Folin-Ciocalteu. Introduire 100 g de tungstate de sodium dihydrat (Na2W0,2H20), 25 g de molybdate de sodium dihydrat (Na21Vlo04,2H,0) et 700 ml deau dans un ballon fond rond de 2 litres col rod. Ajouter 50 ml dacide orthophosphorique p(H3P04) = 1,71 g/ml et 100 ml dacide chlorhydrique concentr p(HCI) = 1 ,19 g/ml. Ajuster 7
